miR-145靶向FSCN1的鉴定研究

袁媛 陈志

摘要：miRNA是参与机体许多生理功能调控的重要因素之一。本研究以miR- 145为研究对象，旨在通过三个靶基因预测软件（rruRanda、PicTar及TargetScan）进行miR-145的靶基因的预测，以此来得到miR-145可能靶向FSCN1基因的结论。通过实时荧光定量PCR、蛋白质免疫印迹检测和双荧光素酶报告试验多重验证筛选miR-145靶基因。研究发现：在细胞水平中，miR-145的过表达会导致FSCN1的mRNA显著下调，当miR- 145被抑制表达的时候，会导致FSCN1的mRNA水平显著上调。此外，荧光素酶报告试验显示，FSCN1基因的3'UTR存在着miR-145的靶向结合位点，其在miR- 145的作用下可显著下调FSCN1活性。研究结果将明晰miR-145通过FSCN1来发挥生物学功能，为探索人类及动物调控机理提供了可靠的参考价值。

关键词：miR-145;FSCN1;靶基因鉴定;荧光素酶报告试验

miRNA （MicroRNA）是长度约为22个核苷酸，且物种之间有着较高保守性的非编码RNA。在动物中，miR-NA调控靶基因表达的典型模式是通过微小核糖核蛋白复合体（miRNAP）結合在靶基因mRNA 3'UTR，以完全碱基配对或不完全碱基配对的方式识别靶基因上的miRNA识别位点（MREs），导致靶基因的翻译抑制或者mRNA的降解。有研究报道，人类基因组可转录上千条miRNA，且超过60%的编码蛋白的基因受到miRNA的调控。miRNA的调控作用涉及有机体的各项生命活动，参与糖尿病、胰岛素抵抗、脂代谢等多种生物学过程，研究结果显示，miR-145对机体免疫有一定的功能和作用。但是关于miR-145在下游调控关系报道还较少。鉴于此，本研究使用双荧光素酶报告系统、qRT-PCR等技术证明，在293-T中探索miR- 145下游靶基因，为探索动物和人类生理功能调控提供了可靠的参考价值。

一、材料和方法

（一）材料

293-T细胞（扬州大学）、胎牛血清澳洲血源（Gibco： 10099141）、Pierce⑩BCA Protein Assay Kit （Ther-mo，美国）、Anti-FSCNI antibody（ ab-cam，英国）、MinuteTM总蛋白提取试剂盒（Invent，美国）、miR-145 mim-iCS和inhibitor （广州锐博：R11053.4）、β—actin （13E5） rabbitmAb （CST，美国）。 （二）miR- 145的mimics和inhibi-tor转染293-T细胞

由前期预实验结果可知，miR-145 mimics的最佳转染浓度为lOOnM，miR- 145 inhibitor转染的最佳浓度为300nM。在铺板24h并且细胞密度约为80%时进行转染，37℃，5% CO2的状态下培养48h。

（三）荧光定量PCR检测表达量

miRNA表达量的检测：对转染细胞中的RNA提取之后，对总RNA中的miRNA进行反转录。根据miRBase数据库提供的miR- 145序列设计定量引物，引物序列为GTCCAGTTTTCCCAC-GAA，下游引物为通用引物，以U6作为内参。

mRNA表达量检测：按反转录试剂盒说明书进行反转录操作，根据NC-BI上牛FSCNI及内参基因CAPDH的序列，设计荧光定量PCR引物（见表1）。

（四）miR- 145靶向FSCNI的双荧光素酶报告基因验证

使用miRbase在线软件预测所有miR- 145的靶基因，将预测到的靶基因使用DAVID在线软件进行分析。本研究构建了FSCNI基因3·-UTR野生型的荧光素酶报告载体及其突变型的载体。FSCN1野生型目的基因带Sacl和Xhol酶切位点及保护碱基的引物设计，用于载体的亚克隆，oligo序列如表2所示。

溶解oligo至50μM，而后选取同体积液体置于1.5ml的离心管中，配成oligo mix。将第一轮的PCR反应产物当做模板，利用oligo-1及oligo- 12进行第二轮的PCR扩增。继而进行切胶回收目的基因片段，用Sacl及Xhol对FSCNI的野生型基因片段进行酶切，37C的温度下进行2h的酶切。而后用Sacl及Xhol对慢病毒载体GP-miRCLO进行酶切，同样是37℃的温度下进行2h的酶切。以上的酶切产物经过电泳以后，利用DNA凝胶回收试剂盒对回收FSCNI WT基因片段以及GP- miR-GLO进行回收。

将经过双酶切所得到的FSCNIWT基因片段及已经线性化的载体，利用DNA T4 ligase连接，按照如下连接体系22℃连接2h。FSCNI突变型基因片段是运用突变PCR的方法设计突变引物，将靶位点序列突变成TCTGACA（见图1）。在获得FSCNI突变目的基因片段以后，后续的步骤与野生型载体的构建相同。

试验一共分成四组来进行：FSCNI WT+ miR- 145 mimic：

FSCNIWT+miR-145 mimic NC; FSCNI Mut+miR-145 mimic：FSCNI Mut+miR-145mimic NC，转染后48h，将培养基吸出。每孔加入75μL的PBS以及75μL的luciferase底物，而后避光进行lOmin的震荡，再用酶标仪来进行萤火虫荧光素酶的荧光值的测定。加入75μL的Stop reagent，避光进行lOmin的震荡以后，用酶标仪来进行海肾荧光素酶的荧光值的测定，并且计算出荧光比值。

二、结果与分析

（一）过表达及干扰miR- 145表达量的效果

在293-T细胞系中转染miR- 145mimics之后，再进行荧光定量的检测，发现转染组的miR- 145要远远高于对照组，表达量的上调超过了114倍。说明本次设计合成的效果非常显著，并且已成功转染进293-T细胞系中发挥其作用。同样，miR-145 inhibi-tor组的miR- 145表达量和对照组进行比较以后发现，降低也呈现了极为显著的差异（见图2）。

（二）熒光定量PCR结果表明miR-145对FSCNI的表达具有干扰作用

由图3可以看出荧光定量PCR的结果，在293-T细胞系中转染了miR-145 mimics以后，基因FSCNI的表达量发生了极显著的下调。与之相反，293-T细胞系在转染了miR-145 inhibi-tor干扰了miR- 145的功能之后，FSCNI的表达量发生了极显著的上调。

（三）双荧光素酶报告载体活性检测结果

对所挑出的质粒进行酶切鉴定，并且与未酶切的质粒均进行凝胶电泳检测。结果显示，部分质粒所对应的克隆并非阳性，其余均为阳性克隆。FSCNI野生型载体阳性克隆的测序由苏州吉玛公司完成，其序列与NCBI数据库中牛FSCNI基因3'UTR进行对比以后，结果是一样的，这表明野生型载体的构建是成功。AACUGGA突变为TCTGACA，这表明成功构建出了FSCNI基因的3'UTR突变型载体。

如图4所示，与对照组进行对比以后发现，miR- 145 WT型载体和miR-145 mimics共转染荧光素酶的荧光值仅为对照组的64% （P< 0.01）;而FSCNI Mut型载体和miR- 145 mimics共转染荧光值差异并不具有统计学意义（P>0.05）。由此表明，miR-145可以靶向FSCNI的3'UTR并有效调控其表达。

三、讨论

近年来，有研究学者发现，有些DNA序列不编码任何蛋白质分子，却发挥着重要的调控作用。RNAi的发现刷新了学者们对于RNA分子的调控基因的表达功能的认识，可见小分子RNA是基因组内的一个隐藏的信息层，有些学者将非编码RNA称为“暗物质”。到目前为止miRNA，siRNA以及piRNA是非编码RNA研究比较透彻的三个成员。siRNA是另一类小分子RNA，其生物合成的作用机制与miR-NA既有相同之处，也有独特之处。本研究使用合成的siRNA作为抑制基因的试验工具，不仅试验效果明显，而且试验效率高。

在本研究中，三种在线预测软件对bta- miR- 145的靶基因进行预测，而后将bta-miR-145 mimics和inhibitor转染至293T细胞系中，检测预测的靶基因FSCNI的mRNA及蛋白表达的变化情况。bta-miR-145不管是过表达或者是抑制表达，FSCNI的mRNA均会发生明显的改变，并且差异具有统计学意义。由此看出，miR- 145以microRNA最通用的作用机制——翻译抑制来对FSCNI的表达进行调控。而bta-miR-145的种子序列UUGACCU与牛FSCNI基因mRNA 3'UTR的一段序列AACUGGA匹配，结合先前从mRNA水平及蛋白水平分别验证miR- 145过表达及干扰以后FSCNI分别产生了下调及上调表达的关系，由此来确定FSCNI是miR-145的靶基因。

双荧光素酶报告基因检测是鉴定miRNA与靶基因作用位点的最为常用的方法。因为在哺乳动物的细胞里并未发现存在内源性萤光素酶，转录完成无需翻译后的修饰，便可生成功能性的萤光素酶，因此，荧光素酶是一种极为理想的报告基因。萤火虫荧光素酶是一种单亚基蛋白，其大小为6lkDa，作为报告基因，而海肾荧光素酶同样是一种单亚基蛋白，其大小为36kDa，作为内参校正基因。当萤火虫荧光素酶的活性测量完成以后，萤火虫荧光淬灭，与此同时，海肾荧光素酶的发射会被激活，对两者荧光值比值变化进行比较，以此可以确定miR-NA对于预测靶基因是否存在作用位点。一般情况下，如果野生型载体的荧光值下调30%以上，便可表明miR-NA对靶基因是具有调控作用的。本研究达到了40%的一个水平，可以说明miR-145靶向FSCNI。

四、小结

通过miRNA靶基因预测网站以及转录组测序数据可以筛选出几个候选靶基因，通过实时荧光定量PCR和双荧光素酶报告基因技术最终筛选出FSCNI与miR-145具有靶向关系。

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