盐处理对两种甘草幼苗的抗氧化系统及总黄酮含量的影响

马红 方龙宝 马海丽 赵凤香 柴薇薇

摘要：研究目的：甘草是一种适生于荒漠盐渍化地区的豆科药用植物，但不同品种甘草对盐的适应性不同，本研究通过比较乌拉尔甘草、黄甘草在不同浓度NaCl处理下抗氧化酶活性及抗氧化物质黄酮含量的差异，初步分析了两种甘草抗氧化系统酶及抗氧物质在盐处理下的变化特征。结果表明：两种甘草均可以通过提高抗氧化酶活性和积累抗氧化物质黄酮来适应盐处理，在50 mmol/L NaCl处理下，两种甘草中超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）、过氧化物酶（Peroxidase，POD）活性在地上和地下呈现出差异，乌拉尔甘草黄酮积累高于黄甘草;在200 mmol/ L NaCl处理下，乌拉尔甘草叶中SOD、POD活性、总黄酮含量均显著高于黄甘草（P<0.05），初步推测乌拉尔甘草在高盐条件下具有更好的抗氧化能力，并能够更好的积累药用活性物质黄酮，因此更适于在盐渍化地区推广种植。

关键词 盐处理;乌拉尔甘草;黄甘草;SOD;POD;黄酮

中图分类号： S567.23    文献标志码：A

随着干旱的频繁发生及化肥的使用和灌溉农业的发展，土壤的次生盐渍化程度日趋严重，已经成为限制植物栽培的重要因素之一。盐胁迫会引起植物细胞的离子胁迫和渗透胁迫，进而导致活性氧（Reactive oxygen species，ROS）的过量积累。但是植物通过长期的进化，形成了复杂的抗氧化防御机制，包括酶途径和非酶途径，来消除过量的活性氧积累。酶途径保护机制中主要有超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）等，其中SOD可以清除超氧阴离子的超氧化物歧化酶活性增加并产生过氧化氢等物质，POD可以催化过氧化氢氧化产生水，来降低膜内不饱和脂肪酸的过氧化程度。非酶途径中直接参与活性氧（ROS）清除的抗氧化物有黄酮、多糖、谷胱甘肽等，这些物质既可以直接同ROS反应，将其还原，又可作为酶的底物在ROS的清除中发挥重要作用。

甘草为豆科多年生药用草本植物，主要品种有乌拉尔甘草 （ Fisch.）、光果甘草（ L）、胀果甘草（Batal.）及黄甘草 Peng.）等，其乌拉尔甘草、黄甘草广泛分布于新疆、甘肃、内蒙古等干旱、半干旱盐渍地区，是一种防风固沙耐盐碱植物。研究不同品种甘草在盐处理条件下抗氧化系统的响应，可以为甘草在盐渍化地区的栽培提供理论基础。已经有研究表明超过200 mmol/L  NaCl对甘草造成胁迫，其体内抗氧化系统遭到破坏，因此本研究选择了低于200 mmol/L的NaCl对乌拉尔甘草和黄甘草进行盐处理。由于甘草中蕴藏着大量的抗氧化物质，如黄酮等，其具有抑菌、抗病毒、抗肿瘤、抗氧化等多种药理作用，但在不同品种、不同产地甘草中的含量差异较大。因此对甘草不产生胁迫的情况下，进行适度的盐处理，将甘草抗氧化酶、甘草黄酮与盐胁迫相关联，比较不同品种甘草中抗氧化酶活性及抗氧化黄酮的变化特征，可以为盐碱条件下开发利用甘草提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1材料培养

实验所用材料乌拉尔甘草、黄甘草种子购买于甘肃酒泉，挑选饱满充实、大小均匀、色泽饱满的甘草种子，用98%浓硫酸消毒并进行催芽，放置在25℃恒温培养箱中培养。待幼苗长出2-3片真叶后移入穴盤中，采用蛭石培养，每周用Hoagland营养液浇灌3次，在室温中进行培养。

1.2 盐处理

当出苗5周左右时，选取长势一致的材料，以Hoagland营养液为对照（CK），选择对甘草并不造成胁迫伤害的盐浓度进行盐处理。Hoagland营养液分别添加50 mmol/L  NaCl和200 mmol/L NaCl进行处理，每2 d更换处理液，分别于处理第7 d、14 d取样，进行酶活性指标测定，处理第60 d取样，进行总黄酮含量测定，每处理设4次重复。

1.3 酶提取液的制备

分别准确称取约0.1g根和叶，加入1ml提取液进行冰浴匀浆，8000 g 4℃离心10min，取上清液，置冰上待测，实验步骤按照试剂盒说明书操作，SOD（SOD-2-Y，苏州科铭）、POD（POD-2-Y，苏州科铭）。

1.4 超声波法提取甘草总黄酮

用50 mmoL/L、200 mmoL/L  NaCl分别处理60 d后，取叶和根清洗干净，在105℃下烘干，粉碎，过100目的筛，然后精确称取叶、根各1.0 g，倒入锥形瓶中，料液比1：20，80%乙醇，超声提取20 min，功率150 W，过滤、共提取2次，合并滤液，最后定容。

取适量提取液于10mL 容量瓶中，加水5mL，振荡片刻，加5%亚硝酸钠溶液0. 5mL，摇匀、放置 6min后加10%的硝酸铝溶液0. 5mL，摇匀放置6min后加5%的氢氧化钠溶液2. 5mL，放置15 min 后蒸馏水定容至10mL，试剂为空白，于510nm 处测吸光度值A，从标准曲线方程中计算出黄酮含量。

计算公式为：C（%）= （V*X）/（100*A*W）*100%

其中： X—比色液中黄酮含量（ mg/mL） V—提取液体积（ mL）; A—取样体积（ mL）; W—甘草重量（g）

1.5 黄酮含量的测定方法

（1）紫外分光光度法：用芦丁代替黄酮做对照标准，采用亚硝酸钠 -硝酸铝比色法，在510nm处测定甘草中总黄酮含量。

（2）工作曲线回归方程：精确称取在 105 ℃干燥恒重的芦丁对照品10mg，用95 %的乙醇溶解，摇匀，定容至10mL，配置成为浓度1mg/mL的芦丁标准品溶液，作为贮备液备用。精密量取上述溶液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 ml，分别加水3 ml，加5%的亚硝酸钠溶液0.5 ml，放置6 min，加10%的硝酸铝0.5 ml，摇匀，放置6min，加入5%的氢氧化钠溶液2.5 ml，混匀，放置15 min后蒸馏水定容10 ml，用紫外分光光度计法在波长510nm 处测吸光度。

将所得数据进行一元线性回归，得芦丁浓度（X）-吸光度（A）方程：X =（A+0.0289）/0.1889相关系数 R=0.9937。

1.6 数据分析

原始数据采用 Excel 2010软件，SPSS 17.0 统计软件进行处理，平均值比较采用 LSD 0.05标准。

2 结果与分析

2.1 SOD活性的变化

SOD是保护植物细胞免受自由基伤害的第1道防线，它是防御活性氧的关键酶。在50 mmol/L NaCl处理下，乌拉尔甘草和黄甘草中SOD活性均随盐处理的时间增长呈现不断升高的趋势。叶中，两种甘草SOD活性显著高于CK（P<0.05），处理14 d时，乌拉尔叶中SOD活性显著高于黄甘草（P<0.05）（图1 A）;在根中，两种甘草SOD活性在处理7d、14d时均显著高于CK（P<0.05），在处理14 d时，黄甘草SOD活性显著高于乌拉尔甘草（P<0.05）（图1 B）。

在200 mmol/L NaCl处理下，两种甘草中SOD活性总体上都随着盐处理时间增加而呈现上升的趋势。在叶中，两甘草SOD活性显著高于CK，处理14d时，乌拉尔SOD活性显著高于黄甘草（P<0.05）（图2 A）;在根中，当200 mmol/L NaCl 处理7d 时，两种甘草SOD活性均显著高于CK，继续处理到14 d时，两种甘草根中的SOD活性差异不显著（P<0.05）（图2 B）。

2.2 POD活性的变化

在50 mmol/L NaCl处理下，两种甘草叶中POD活性呈现先上升后下降的趋势（图3 A），但黄甘草叶中的POD活性显著高于乌拉尔甘草（P<0.05）（图3 A）;根中乌拉尔甘草POD活性却呈现出始终上升的趋势，而黄甘草中的POD活性却先增高后下降，处理14d时，乌拉尔POD活性显著高于黄甘草（P<0.05）（图3 B）。

在200 mmol/L  NaCl下，乌拉尔甘草葉中POD活性呈现先上升后下降的趋势，而在黄甘草中随着盐处理时间逐渐上升，在处理7 d、14 d时，乌拉尔叶中POD活性显著高于黄甘草（P<0.05） （图 4 A）;在根中，两种甘草根中POD活性随着盐处理的时间呈现逐渐上升的趋势，乌拉尔甘草POD活性始终高于黄甘草（P<0.05）（图 4 B）。

2.3 黄酮含量的变化

在叶中，两种甘草总黄酮含量呈现不同的变化，乌拉尔甘草总黄酮含量随着盐浓度增强而呈现上升的趋势，而黄甘草总黄酮含量随着盐浓度增强逐渐下降。在200 mmol/L处理下，乌拉尔叶中总黄酮含量达1.30%，根中高达1.01%，无论是根还是叶中，乌拉尔总黄酮含量均显著高于黄甘草（P<0.05）。说明一定的盐处理促进了乌拉尔甘草黄酮含量的积累，但是较高浓度的盐处理却抑制了黄甘草黄酮的合成与积累（表1）。

3 讨论

本研究表明，两种甘草中SOD活性随盐处理强度增大而增大，而POD活性随着盐处理浓度强度先上升再下降，这与万春阳等的研究一致，表明在一定的盐处理下，甘草体内积累了活性氧，SOD活性增强能有效地清除氧自由基，阻止膜的破坏及过氧化，实现自我调节抵御，POD能够及时清除HO，使HO在体内含量维持在较低水平，正是由于以上这些保护酶在盐处理下增强，维持较高的水平，才使得甘草保持一定的耐盐性。本研究中低浓度的盐处理下（50 mmol/L NaCl），两种甘草均通过保护酶活性升高来提高自身的防御性，有效地清除氧自由基、降低膜脂过氧化水平，从而减轻膜伤害程度;而在较高浓度的盐处理下（200 mmol/L NaCl），黄甘草体内酶系统的稳定性被破环，因此POD保护酶的活性不能维持较高水平，出现下降趋势，而乌拉尔甘草却能够在200 mmol/L NaCl处理下始终保持高的POD活性，且在根中POD活性显著高于黄甘草，根中合成POD的能力优于黄甘草，说明乌拉尔甘草有较强的清除HO的能力。

研究表明，黄酮类化合物是具有抗氧化性和促氧化性两种性质的天然活性因子。 Yao等用CCl诱导肝损伤模型进行有机体实验，证明黄酮具有抗氧化性，郑学钦等也证实了黄酮具有清除活性氧的作用。本实验中，乌拉尔甘草总黄酮含量随着NaCl浓度的增加而升高，而黄甘草中出现了相反的特征，说明在适度盐处理下，乌拉尔甘草相较于黄甘草能更多的积累黄酮。这与万世杰等的研究相似，其研究发现一定浓度的NaCl胁迫可以提高胀果甘草子叶愈伤组织的甘草黄酮含量。因此，我们推测盐渍环境对乌拉尔甘草总黄酮含量的积累能起到一定的促进作用，但对黄甘草总黄酮含量积累起到抑制作用。

本研究从抗氧化酶及抗氧化物质总黄酮的变化特征揭示了两种甘草对盐的适应性，可以为两种甘草在盐渍化地区的推广种植及开发利用提供一定的参考依据。根据本研究，我们初步认为乌拉尔甘草更适合在盐渍化地区推广种植，且适度的盐有利于乌拉尔甘草中的有效活性成分黄酮的开发利用。未来对于甘草在盐渍条件下的开发利用，还需进行更加深入的研究。

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