甜瓜半粒干种子DNA提取方法的优化

夏玲 梁昕景 王学林 杨小锋

摘要：【目的】优化甜瓜半粒干种子DNA提取方法，为甜瓜相关分子研究提供技术支持。【方法】以甜瓜半粒干种子为材料，比较改良CTAB法、SDS法、高盐低pH法和尿素法4种提取方法的DNA提取效果，并对改良CTAB法中的提取液CTAB浓度、裂解时间、苯酚抽提次数等进行优化，以琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计分别检测DNA的质量和纯度。最后通过SSR分析验证优化后改良CTAB法提取DNA的效果。【结果】4种提取方法中，改良CTAB法提取的DNA提取率最高，且DNA质量和纯度均高于其他提取方法。优化得到改良CTAB法的最佳提取条件为：提取液CTAB浓度2%，裂解时间20 min，苯酚抽提1次[先用苯酚/氯仿/異戊醇（25∶24∶1）抽提1次，再用氯仿/异戊醇（24∶1）抽提 1次]。在此条件下，提取的甜瓜半粒干种子DNA质量和纯度较好，以此为模板进行SSR分子标记分析时，电泳条带稳定、清晰，基本无杂带，可清楚区分品种间的差异。【结论】优化后的改良CTAB法提取甜瓜半粒干种子DNA效果较好，可满足甜瓜种子分子标记和遗传多样性分析等分子实验需求。

关键词： 甜瓜;干种子;DNA提取;CTAB法;优化

0 引言

【研究意义】甜瓜属于葫芦科（Cucurbitaceae）黄瓜属（Cucumis）一年生草本植物，是我国重要的经济作物之一。近年来，随着分子育种技术的发展，甜瓜分子育种日益受到广大研究者的关注。DNA提取是分子育种和分子生物学研究的基础，其质量和纯度对要求较高的分子实验具有重要影响（王振东等，2008;陈汝等，2017）。同时，高质量的DNA是基因克隆及SRAP、RAPD、AFLP等分子标记技术的前提条件。因此，优化DNA提取方法对提高研究结果的准确性具有重要意义。【前人研究进展】目前，有关甜瓜不同组织基因组DNA提取方法的研究报道较多。陈金体和王晓峰（2007）采用CTAB法提取甜瓜幼苗的DNA，从DNA分子水平对甜瓜纯度进行鉴定。李菊芬等（2008a）采用尿素提取法提取甜瓜子叶的DNA，从DNA分子水平对甜瓜杂种的纯度进行鉴定。马海财等（2010）采用改良CTAB法提取甜瓜幼嫩叶片DNA，并构建甜瓜后代群体的DNA遗传图谱。李超等（2017）采用改良CTAB法提取甜瓜叶片DNA，从DNA分子水平对甜瓜新品种纯度和真实性进行鉴定研究。赵光伟等（2017）采用CTAB法提取甜瓜品种众天翠雪叶片DNA，从DNA分子水平进行品种纯度鉴定等。以上研究主要采用幼苗、子叶、嫩叶等为材料，需经过浸种、催芽、育苗等前期处理过程，不但周期长，而且提取方法费时费力，工作效率较低。至今，仅李菊芬等（2008a）研究发现，以甜瓜干种子为材料可提取到质量较好的DNA。【本研究切入点】以甜瓜半粒干种子为材料，无需育苗，随时可提取其DNA，不仅节省育苗时间、减少投入成本，还不伤及种胚，种子仍保持活力可育成苗用于后续试验，具有简便、快速、经济等优点，但目前鲜见对甜瓜半粒干种子DNA提取方法进行优化的研究报道。【拟解决的关键问题】以甜瓜半粒干种子为材料，比较改良CTAB法、SDS法、高盐低pH法和尿素法4种方法提取DNA的效果，并对改良CTAB法中的提取液CTAB浓度、裂解时间、苯酚抽提次数等进行优化，以琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测DNA的质量和纯度，最后通过SSR分析验证优化后改良CTAB法提取DNA的效果，为甜瓜分子育种辅助标记开发、种质资源遗传多样性研究、种子纯度鉴定等分子生物学研究提供技术支持。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

供试材料为甜瓜品种金蜜六号的半粒干种子，由三亚市南繁科学技术研究院保存提供。CTAB、SDS、尿素、乙酸、蛋白酶K、乙醇、异丙醇、Tris饱和酚、氯仿/异戊醇（24∶1）、异丙醇、6×Loading Buffer、TE、DL2000 DNA Marker和琼脂糖等均购自生工生物工程（上海）股份有限公司。主要仪器设备：高速冷冻离心机（Eppendorf中国有限公司）、BiometraTAdvanced PCR仪（德国耶拿分析仪器股份公司）、Speed mix研磨仪（德国耶拿分析仪器股份有限公司）、超微量核酸蛋白测定仪（德国耶拿分析仪器股份有限公司）和琼脂糖凝胶电泳仪设备（北京六一生物科技有限公司）等。

1. 2 试验方法

1. 2. 1 样品预处理 用已消毒的剪刀剪取甜瓜干种子的胚乳部分（约为种子的1/2处），去除种壳后备用。

1. 2. 2 不同提取方法比较试验 采用改良CTAB法、SDS法、高盐低pH法和尿素法4种方法提取甜瓜半粒干种子DNA。改良CTAB法：参照董永军等（2017）的改良CTAB法，稍作改动，具体步骤：取准备好的样品放入2 mL离心管，放入直径8 mm的钢珠，并加入1 mL CTAB提取液，用研磨仪研磨1～2 min。向研磨好的样品中加入20 ng/mL蛋白酶K 5 μL，然后置于65 ℃水浴锅中水浴30 min（期间不断振荡离心管）。取出离心管，冷却至室温，加入等体积的酚/氯仿/异戊醇（25∶24∶1），颠倒混匀，静置5 min，12000 r/min离心12 min。取上清液，加入等体积的氯仿/异戊醇（24∶1）轻缓颠倒混匀，静置5 min，12000 r/min离心12 min。取上清液，加入等体积的-20 ℃预冷异丙醇，轻缓颠倒混匀，于-20 ℃冰箱放置30 min以上，10000 r/min离心6 min后弃上清液。用70%乙醇洗涤沉淀2～3次，置于通风橱风干后溶于30 μL TE中备用。加入终浓度50 μg/mL的RNase，37 ℃保温30 min。最后将DNA样品置于-20 ℃冰箱中保存备用。SDS法参照彭锁堂等（2002）的研究方法进行操作，高盐低pH法参照杨萍等（2004）、杨恩等（2005）的研究方法进行操作，尿素法参照李菊芬等（2008b）的研究方法进行操作。最后检测DNA的质量和纯度。

1. 2. 3 改良CTAB法提取甜瓜半粒种子DNA的优化试验

1. 2. 3. 1 裂解时间优化 采用2% CTAB提取液提取甜瓜半粒干种子DNA，先用苯酚/氯仿/异戊醇（体积比25∶24∶1）抽提1次，再用氯仿/异戊醇（体积比24∶1）抽提1次，裂解时间设为10、20和30 min，其他条件同1.2.2。最后检测DNA的质量和纯度。

1. 2. 3. 2 CTAB提取液浓度优化 分别用1%、2%和3% CTAB提取液提取甜瓜半粒干种子DNA，裂解时间30 min，先用苯酚/氯仿/异戊醇（体积比25∶24∶1）抽提1次，再用氯仿/异戊醇（体积比24∶1）抽提1次，其他條件同1.2.2。最后检测DNA提取质量和纯度。

1. 2. 3. 3 苯酚抽提次数优化 用2% CTAB提取液提取甜瓜半粒干种子DNA，裂解时间30 min，抽提方法设以下3种：苯酚抽提0次，即仅用氯仿/异戊醇（体积比24∶1）抽提1次;苯酚抽提1次，即先用苯酚/氯仿/异戊醇（体积比25∶24∶1）抽提1次，再用氯仿/异戊醇（体积比24∶1）抽提1次;苯酚抽提2次，即先用苯酚/氯仿/异戊醇（体积比25∶24∶1）抽提2次，再用氯仿/异戊醇（体积比24∶1）抽提1次，其他条件同1.2.2。最后检测DNA提取质量和纯度。

1. 2. 4 DNA提取质量和纯度检测

1. 2. 4. 1 紫外分光光度法检测 取2 μL DNA提取液，利用超微量核酸蛋白测定仪测定DNA的质量浓度（ng/μL）及纯度（在260、280和230 nm波长处的吸光值），DNA含量（mg）=质量浓度×50×10-6;DNA提取率（mg/g）=DNA含量/半粒种子干重。DNA质量判定方法：纯DNA的OD260/OD280≈1.8，当OD260/OD280为1.8～2.0时属于正常范围，<1.8说明有蛋白质污染，>2.0说明有RNA污染;OD260/OD230>2.0，说明无多糖、酚类和小分子杂质污染。

1. 2. 4. 2 琼脂糖凝胶电泳检测 提取的DNA用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测（120 V，25 min），并用凝胶成像系统进行观察拍照。

1. 2. 5 SSR分析验证优化后改良CTAB法提取DNA的效果 采优化后的CTAB法提取8个甜瓜品种半粒干种子DNA，以其作为模板进行SSR分子标记分析，TJ10-F（5'-ACGAGGAAAACGCAAAATCA-3'）和TJ10-R（5'-TGACGTGGACGACATTTTT-3'）引物为甜瓜的SSR核心引物（宋海斌等，2012）。PCR反应体系20.0 μL：10×Buffer（含Mg2+）2.0 μL，dNTP 2.0 μL，TJ10F和TJ10-R引物各1.0 μL，Taq DNA聚合酶0.2 μL，DNA模板2.0 μL ddH2O补足至20.0 μL。扩增程序：94 ℃预变性5 min;94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，进行35个循环;72 ℃延伸10 min。PCR产物用2.0%琼脂糖凝胶电泳检测（120 V，25 min），并用凝胶成像系统进行观察拍照。

2 结果与分析

2. 1 不同提取方法的比较结果

以改良CTAB法、SDS法、高盐低pH法和尿素法分别提取甜瓜半粒干种子DNA，并用紫外分光光度计和琼脂糖电泳检测DNA提取效果，结果如图1和图2所示。利用4种提取方法均能获得甜瓜半粒干种子DNA，DNA条带干净，无明显的RNA和蛋白污染，其中，改良CTAB法的DNA提取率最高，为0.053 mg/g，且DNA条带最亮，其次是SDS法，高盐低pH法的DNA提取率最低，仅为0.024 mg/g，DNA条带较弱。4种提取方法提取的DNA OD260/OD280为1.83～2.10，其中SDS法和改良CTAB法提取的DNA OD260/OD280更接近1.80，表明这2种提取方法提取的DNA纯度较高。仅改良CTAB法提取的DNA OD260/OD230>2.0，其他3种方法均小于2.00，说明SDS法和尿素法提取的DNA被酚类、多糖和小分子杂质污染。综上所述，改良CTAB法为提取甜瓜半粒于种子DNA的最佳方法。

2. 2 裂解时间对改良CTAB法DNA提取效果的影响

由图3可知，改良CTAB法DNA提取率随裂解时间增加呈先升高后降低的变化趋势，即裂解时间为20 min时DNA提取率达最大值，其原因是细胞裂解释放DNA是一个缓慢溶出的过程，时间的延长有助于DNA溶出，但超过一定时间后样品DNA不再溶出，即使裂解时间继续增加，DNA提取率也不再升高。不同的裂解时间对提取的DNA质量同样影响较大，当裂解时间为10和20 min时，提取的DNA质量无明显差异，OD260/OD280和OD260/OD230均在正常范围内，且DNA条带清晰，无明显拖尾现象，但裂解时间为20 min时，DNA条带更亮（图4）。当裂解时间为30 min时，提取的DNA质量明显下降，OD260/OD280达2.10，说明其被RNA污染，OD260/OD230为1.75，说明其被酚类、多糖和小分子杂质污染，其电泳图（图4）也表现出该问题。综上所述，采用改良CTAB法提取甜瓜半粒干种子DNA时，最佳裂解时间为20 min。

2. 3 CTAB提取液浓度对DNA提取效果的影响

由图5和图6可知，随CTAB提取液浓度的增加，DNA提取率呈先增加后降低的变化趋势，即2% CTAB提取液的DNA提取率达最大值，且DNA条带最亮，分布集中，无拖尾现象，OD260/OD280为1.85，OD260/OD230为2.11，而另外两个CTAB提取液浓度提取的DNA OD260/OD230均小于2.00;3% CTAB提取液的DNA提取率略有降低，且DNA的质量和纯度均降低，OD260/OD280为1.78，OD260/OD230为1.63。综上所述，1%和3% CTAB提取液提取的甜瓜半粒干种子DNA易被多酚、糖类和小分子杂质污染，2% CTAB提取液提取甜瓜半粒干种子DNA的效果最佳。

2. 4 苯酚抽提次數对改良CTAB法DNA提取效果的影响

由图7和图8可看出，随着苯酚抽提次数的增加，改良CTAB法DNA提取率明显降低，当用苯酚抽提2次时，提取的DNA质量较好，OD260/OD280为1.85，OD260/OD230为2.05，但DNA提取率仅为0.041 mg/g;而未经苯酚抽提时，虽然DNA提取率最高，但DNA质量较差，OD260/OD280为2.23，OD260/OD230为1.07，说明被较多的蛋白、多糖和酚类物质污染。由图8也可看出，不用苯酚抽提时，提取DNA条带最亮，但有明显拖带，而用苯酚抽提过1次或2次的DNA条带表现较集中，拖尾少。因此，从实际操作和成本综合考虑出发，DNA最佳抽提方式为先用苯酚/氯仿/异戊醇抽提1次，再用氯仿/异戊醇抽提1次。

2. 5 优化后的改良CTAB法提取DNA质量验证结果

以优化后的改良CTAB法提取甜瓜半粒干种子DNA，以此为模板进行SSR分子标记分析，结果如图9所示。电泳条带稳定、清晰、基本无杂带，可清楚区分品种间的差异，表明从优化后的改良CTAB法提取甜瓜半粒干种子DNA中能扩增得到稳定的谱带，完全满足SSR分子标记分析的要求。

3 讨论

前人研究多以甜瓜幼苗、子叶、嫩叶等为材料提取基因组DNA（陈金体和王晓峰，2007;马海财等，2010;李超等，2017）。本研究以半粒干种子为材料提取甜瓜基因组DNA，结果表明，改良CTAB法的提取效果优于SDS法、高盐低pH法和尿素法，与李菊芬等（2008a）研究认为尿素法提取甜瓜种子DNA最佳的结论不一致。本研究中，改良CTAB法和尿素法均能提取获得较好的DNA，但尿素法提取的DNA被苯酚、多糖和小分子杂质污染，且DNA提取率相对较低。目前，CTAB法已广泛应用于提取大豆（姚丹等，2009）、水稻（李炫丽等，2011;王惠等，2013）、小麦（丁海燕和丁晨，2016）、玉米（董永军，2017）等作物种子DNA，提取效果较好。

本研究通过分析改良CTAB法中CTAB提取液浓度对DNA提取效果的影响，结果发现，CTAB提取液浓度不宜过高，否则会明显影响DNA的质量，与姚丹等（2009）的研究结论一致，其原因可能是CTAB具有较强去污能力，其溶解细胞膜后结合核酸，并与蛋白和多聚糖形成复合物，使核酸更容易分离，但若样品量较少，过高浓度的CTAB不易去污，造成DNA提取质量下降。因此，适宜的CTAB提取液浓度对提取高质量的DNA非常重要。

DNA提取过程中水浴裂解时间对DNA的释放至关重要，裂解时间过短，DNA释放不完全导致难以获得DNA;但时间过长，会增加DNA降解的风险。本研究通过分析不同裂解时间对改良CTAB法DNA提取效果的影响，结果发现，裂解时间为20 min时DNA提取率最高，且DNA条带清晰，无明显的拖尾现象，说明采用改良CTAB法提取甜瓜半粒干种子DNA时，最佳裂解时间为20 min，比以甜瓜幼苗、子叶、嫩叶等为材料的裂解时间短（陈金体和王晓峰，2007;马海财等，2010;李超等，2017），其原因可能是本研究以半粒干种子为材料提取的DNA较少，所以所需的时间较少。

本研究仅初步优化改良CTAB法提取甜瓜半粒干种子DNA的相关影响因素，为了保证后续甜瓜分子标记分析的顺利开展，还应根据不同的实验要求做进一步改进，有效提高DNA质量，为甜瓜分子育种研究打下基础。

4 结论

优化后的改良CTAB法提取甜瓜半粒干种子DNA效果较好，可满足甜瓜种子分子标记和遗传多样性分析等分子实验需求。

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（责任编辑 陈 燕）