南方红豆杉MCT基因克隆、功能验证及组织表达特异性检测

简东琴 曾令江 杨颖舫 杨春贤

摘要：【目的】克隆南方红豆杉的2-C-甲基-D-赤藓醇-4-磷酸胱氨酰转移酶（MCT）基因（TcMCT），分析其功能，并检测组织表达特异性，为深入研究TcMCT基因在紫杉醇生物合成中的作用机制提供理论依据。【方法】采用cDNA末端快速扩增（RACE）技术获得TcMCT基因的cDNA全长序列，对其编码蛋白进行生物信息学分析及亚细胞定位，采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测TcMCT基因的组织表达模式，并在大肠杆菌中超表达该基因以验证其功能。【结果】克隆获得的TcMCT基因cDNA序列全长为1293 bp，开放阅读框（ORF）为942 bp，编码313个氨基酸。TcMCT蛋白与其他植物MCT蛋白中均含保守的MEP结合位点和CTP结合位点，但在N端氨基酸序列保守性较差，其中与同为裸子植物银杏GbMCT蛋白的亲缘关系最近，氨基酸序列的相似性为59.3%。TcMCT蛋白的三级结构与AtMCT蛋白相似，均属于同源二聚体。TcMCT蛋白N端含84个氨基酸残基的质体转运肽，且以Arg88作为切割位点，定位于叶绿体中。TcMCT基因在南方红豆杉不同组织中均有表达，在绿色树皮中的相对表达量显著高于其他组织（P<0.05，下同），且在老叶和嫩叶中的相对表达量显著高于茎和根，在茎和根中的表达量极少甚至不表达。大肠杆菌中超表达TcMCT基因可促进β-胡萝卜素大量积累。【结论】不同物种MCT氨基酸序列具有较高的保守性，TcMCT基因具有明显的组织表达特异性，可调控萜类物质如β-胡萝卜素等的生物合成，推测其在紫杉醇生物合成中发挥重要调控作用。

关键词： 南方红豆杉;2-C-甲基-D-赤藓醇-4-磷酸胱氨酰转移酶（MCT）;生物信息学分析;功能验证;紫杉醇

0 引言

【研究意义】南方红豆杉（Taxus chinensis）为我国特有种，其树形美观，木质优良，富含紫杉醇，是罕见的一树三用树种（吴继刚，2015）。临床研究发现，紫杉醇在治疗乳腺癌、卵巢癌和肺癌等方面疗效显著，是一种高效新型的抗癌药物（Armstrong et al.，2006;Miller et al.，2007;Rezazadeh et al.，2016;Oudin et al.，2017）。此外，紫杉醇可提高植物抵抗真菌的能力（Soliman et al.，2015）。异戊烯焦磷酸（IPP）是紫杉醇、胡萝卜素等萜类化合物生物合成的重要前体物质，而2-C-甲基-D-赤藓醇-4-磷酸胱氨酰转移酶（MCT）不仅是参与IPP合成的关键酶，还是萜类物质生物合成MEP途径中的关键酶之一（Rohdich et al.，1999;Croteau et al.，2006）。因此，克隆TcMCT基因，并分析其生物学功能，对提高红豆杉紫杉醇含量具有重要意义，同时可为南方红豆杉分子育种提供理论依据。【前人研究进展】MCT参与4-二磷酸胞苷-2-C-甲基赤藓糖醇（CDP-ME）的合成。Rohdich等（1999）将带有14C标记的CDP-ME转入辣椒，结果发现带有14C标记的CDP-ME在辣椒质体中参与类胡萝卜素生物合成，说明MCT在萜类化合物生物合成过程中发挥重要作用。迄今为止，已从拟南芥（Rohdich et al.，2000）、杜仲（刘攀峰，2012）、胡黄连（郑玉娟等，2014）、雷公藤（董宇茹等，2015;宋雅迪等，2018）、青蒿（张曼等，2016）和卷叶贝母（张甜甜等，2018）等被子植物中克隆获得MCT基因，但关于其功能鉴定的研究报道较少。Rohdich等（2000）研究发现，拟南芥AtMCT蛋白的N端含有质体转运肽序列，与MEP途径定位于质体相吻合，通过抑制AtMCT基因的表达能下调贝壳杉烯的生物合成。董宇茹等（2015）、宋雅迪等（2018）研究发现，雷公藤TwMCT基因属于MCT基因家族成员，且受茉莉酸甲酯（MeJA）诱导表达，通过RNAi技术抑制雷公藤TwMCT基因表达后，植株中的雷公藤甲素和雷公藤红素含量显著下降。张曼等（2016）从青蒿中克隆获得AaMCT基因cDNA序列，该基因编码蛋白定位于叶绿体中，且在青蒿分泌型腺体中特异性表達，将其转入拟南芥中超表达后能显著促进叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素等萜类化合物合成。由此可见，在被子植物中，不同物种的MCT基因均对萜类化合物合成具有重要调控作用。目前，在裸子植物中仅银杏MCT基因的相关研究被报道。Kim等（2006）首次从银杏中克隆得到GbMCT基因，并通过烟草细胞叶绿体荧光染色试验证明GbMCT蛋白N端含88个氨基酸的质体转运肽。【本研究切入点】至今，鲜见有关南方红豆杉中紫杉醇生物合成途径中关键酶基因MCT的研究报道。【拟解决的关键问题】采用cDNA末端快速扩增（RACE）技术从南方红豆杉中克隆TcMCT基因的cDNA序列全长，对其进行生物信息学分析，采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测其组织表达特性，并在大肠杆菌中超表达该基因以验证其功能，以期从分子水平探讨MCT基因在萜类化合物合成中的作用，为紫杉醇生物合成研究提供候选功能基因。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

供试的3株南方红豆杉均由西南大学实验基地提供，树龄为4年，长势基本一致，由西藏农牧学院兰小中教授鉴定为T. media Rehd. var. mairei Lemee et Levl。本氏烟草种子、大肠杆菌DH5α和XL1-Blue均由西南大学生命科学学院实验室保存提供。pAC-BETA和pTrc-AtIPI质粒由马里兰大学的Francis X Cunningham博士惠赠。主要试剂：植物RNA提取试剂盒和FastQuant cDNA第一链合成试剂盒均购自天根生化科技（北京）有限公司，BD SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit购自美国CLONTECH公司;RNA PCR Kit（AMV） Ver.3.0、3'-Full RACE Core Set试剂盒和SYBR Premix Ex Taq II（Perfect Real Time）购于日本TaKaRa公司。主要仪器设备：Centrifuge 5417R冷冻离心机（Eppendorf，德国）、DYY-8C电泳仪（北京市六一仪器厂）、梯度PCR仪（Bio-Rad，美国）和LSM700激光共聚焦显微镜（ZEISS，德国）等。

1. 2 RNA提取及cDNA合成

将南方红豆杉植株从土中连根拔出，收集主根中段部，剥取绿色树皮，采集所有的新叶（当年新生叶）和老叶（多年生叶），分别将这些组织置于液氮中速冻，用于提取总RNA。使用HITACHI3010分光光度计检测RNA浓度，按照植物RNA提取试剂盒说明提取南方红豆杉各组织RNA，并参照RNA PCR Kit（AMV）Ver.3.0试剂盒说明合成cDNA第一链。

1. 3 TcMCT基因cDNA全长序列克隆

根据NCBI已公布的拟南芥（Arabidopsis thalia-na）、银杏（Ginkgo biloba）等物种MCT基因的核苷酸序列，利用Vector NTI 8.0进行多重序列比对，选取最保守核苷酸序列设计简并引物（表1）。以南方红豆杉绿色树皮cDNA为模板，PCR扩增TcMCT基因的核心片段。反应体系：10×PCR Buffer 5.0 µL，25 mmol/L MgCl2 3.0 µL，10 mmol/L dNTP 1.0 µL，10 µmol/L TCMCT-F和TCMCT-R游引物各1.0 µL，cDNA模板1.0 µL，2.5 U Taq DNA聚合酶0.5 µL，ddH2O补足至50.0 µL。扩增程序：94 ℃预变性4 min;94 ℃ 45 s，61 ℃（每个循环降低0.5 ℃）45 s，进行20个循环;94 ℃ 45 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，进行25个循环;72 ℃延伸10 min。

根据3'-Full RACE Core Set试剂盒说明获得3' RACE-Ready cDNA，并以此为模板PCR扩增TcMCT基因的3'端序列。3'端序列第1次扩增反应体系：10×PCR Buffer 5.00 µL，25 mmol/L MgCl2 3.00 µL，10 mmol/L dNTP 1.00 µL，10 µmol/L TcMCT3-1和M13引物各1.00 µL，3'RACE-Ready cDNA 1.00 µL，Ex TaqTM HS 0.25 µL，ddH2O补足至50.00 µL。扩增程序：94 ℃预变性4 min;94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，进行30个循环;72 ℃延伸10 min。3'端序列第2次扩增反应体系：10×PCR Buffer 5.00 µL，25 mmol/L MgCl2 3.00 µL，10 mmol/L dNTP 1.00 µL，10 µmol/L TcMCT3-2和 M13引物各0.50 µL，第1次扩增产物50倍稀释液1.00 µL，Ex TaqTM HS 0.25 µL，ddH2O补足至50.00 µL。第2次扩增程序与第1次扩增程序相同。根据BD SMARTTM RACE cDNA Amplification试剂盒说明获得5'RACE-Ready cDNA，并以此为模板PCR扩增TcMCT基因的5'端序列。5'端序列第1次扩增反应体系：10×BD Advantage2 PCR Buffer 2.5 µL，50×BD Advantage2 Polymerase Mix 0.5 µL，10 mmol/L dNTP 0.5 µL，10 µmol/L TcMCT5-1引物1.0 µL，10 µmol/L UPM引物（Long和Short）2.5 µL，5'RACE-Ready cDNA 1.5 µL，PCR-Grade Water补足至25.0 µL。扩增程序：95 ℃预变性1 min;94 ℃ 30 s，68 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，进行30个循环;72 ℃延伸8 min。第2次扩增反应体系：10×BD Advantage2 PCR Buffer 5.0 µL，50×BD Advantage2 Polymerase Mix 1.0 µL，10 mmol/L dNTP 1.0 µL，10 µmol/L TcMCT5-2和NUP引物1.0 µL，第1次擴增产物50倍稀释液1.0 µL，PCR-Grade Water补足至50.0 µL。第2次扩增程序与第1次扩增程序相同。

TcMCT基因核心片段及3'端和5'端序列的PCR产物均用1%琼脂糖凝胶电泳检测，在凝胶成像系统下观察分析并拍照记录，切胶回收目的片段后分别连接至pMD18-T载体上，转化大肠杆菌DH5α，菌液PCR验证后挑取阳性克隆送至上海英骏生物技术有限公司测序。

将以上测序结果进行拼接获得TcMCT基因cDNA全长序列，以此设计获得TcMCT基因cDNA全长序列的PCR特异性引物（TcMCT-F1和TcMCT-R1）（表1），并利用南方红豆杉绿色树皮cDNA为模板进行PCR扩增。反应体系：10×PCR Buffer 5.0 µL，25 mmol/L MgCl2 3.0 µL，10 mmol/L dNTP 1.0 µL，10 µmol/L TcMCT-F1和TcMCT-R1引物各1.0 µL，cDNA模板1.0 µL，2.5 U Taq DNA聚合酶0.5 µL，ddH2O补足至50.0 µL。扩增程序：94 ℃预变性4 min;94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，进行35个循环;72 ℃延伸1 min。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，在凝胶成像系统下观察分析并拍照记录，切胶回收目的片段后连接至pMD18-T载体，转化大肠杆菌DH5α，菌液PCR验证后挑取阳性克隆送至上海英骏生物技术有限公司测序。

1. 4 生物信息学分析

使用Vector NTI 8.0分析TcMCT基因编码区序列，并将其翻译成氨基酸序列，利用NCBI中的BLASTp和CluxtalX进行氨基酸序列多重比对，利用ExPASy预测蛋白的相对分子质量和理论等电点（pI），利用SWISS-MODEL对蛋白三级结构进行同源建模，利用MEGA 4.1的邻位相联法构建系统发育进化树。

1. 5 亚细胞定位

使用ChloroP分析TcMCT蛋白的質体转运肽序列（Xiao et al.，2009），根据编码质体转运肽的核苷酸序列（TP）设计其PCR扩增特异性引物（TcMCT-SF和TcMCT-SR）（表1），将该序列与植物表达载体pCAMBIA1300-GFP连接以构建重组质粒pCAMBIA1300-TP-GFP。根据Yoo等（2007）的方法制备烟草原生质体。在聚乙二醇（PEG）介导下分别将pCAMBIA1300-TP-GFP和pCAMBIA1300-GFP（阴性对照）转至化烟草原生质体中，使用LSM700激光共聚焦显微镜观察绿色荧光蛋白（GFP）在细胞中的定位情况（Suire et al.，2000）。

1. 6 qRT-RCR检测

按照植物RNA提取试剂盒说明分别提取南方红豆杉根、茎、老叶、嫩叶和绿色树皮的总RNA，使用HITACHI3010分光光度计检测其浓度，并用琼脂糖凝胶电泳检测其质量。将质量好的总RNA按FastQuant cDNA第一链合成试剂盒说明去除gDNA并反转录合成cDNA第一链。将cDNA用RNase-Free ddH2O稀释20倍后用作模板，按照SYBR Premix Ex Taq II（Perfect Real Time）试剂盒说明进行qRT-PCR检测。反应体系：2×SYBR Premix Ex Taq II 10.0 µL，10 µmol/L qTcMCT-F和qTcMCT-R引物（表1）各1.0 µL，cDNA模板1.0 µL，RNase Free H2O补足至20.0 µL。扩增程序：95 ℃预变性30 s;95 ℃ 15 s，55 ℃ 15 s，68 ℃ 15 s，进行40个循环。以18S作为内参基因，采用2-∆∆Ct计算基因的相对表达量。其中，每个样品重复3次，统计分析用 t 检验。

1. 7 功能互补验证

大肠杆菌体内的MEP途径能提供β-胡萝卜素前体分子IPP和二甲基烯丙基焦磷酸（DMAPP），但缺失从前体分子到β-胡萝卜素合成途径中的4个酶基因：香叶基香叶基焦磷酸酶（crtE）、八氢番茄红素合成酶（crtB）、八氢番茄红素脱饱和酶（crtI）和番茄红素环化酶（crtY），因此，大肠杆菌不能合成β-胡萝卜素。若将上述4个基因重组至pAC-BETA质粒上，转入大肠杆菌中即可在其体内构建β-胡萝卜素途径，但无法大量积累β-胡萝卜素，因此，大肠杆菌菌落呈白色。将pTrc-AtIPI质粒与pAC-BETA共转化大肠杆菌，因大肠杆菌体内超表达拟南芥IPI基因（AtIPI，IPI为IPP异构酶）能促进β-胡萝卜素积累，故菌落呈现橘黄色（Gao et al.，2006）。基于上述原理，参照刘万宏（2008）的方法，设计扩增TcMCT基因编码区的引物（pTcMCT-F和pTcMCT-R），将PCR扩增获得的TcMCT基因编码区序列替换pTrc-AtIPI质粒上的AtIPI基因即可获得pTrc-TcMCT重组质粒。以pTrc-TcMCT与pAC-BETA共转染大肠杆菌XL1-Blue后涂布于含氯霉素和氨苄霉素的LB固体培养基上培养，筛选出阳性克隆。此外，构建拟南芥pTrc-AtMCT重组质粒（构建方法同上），将其与pAC-BETA共转染大肠杆菌XL1-Blue后涂布于含氯霉素和氨苄霉素的LB固体培养基上，用作阳性对照。以大肠杆菌XL1-Blue、pAC-BETA转染大肠杆菌XL1-Blue、pTrc-TcMCT转染大肠杆菌XL1-Blue及pTrc与pAC-BETA共转染大肠杆菌为阴性对照。

2 结果与分析

2. 1 TcMCT基因cDNA全长序列克隆及序列分析结果

PCR扩增获得的TcMCT基因（GenBank登录号为KC110615.1）cDNA全长序列为1293 bp（图1），其中，5'端非翻译区为58 bp，3'端非翻译区为293 bp，开放阅读框（ORF）为942 bp，编码313个氨基酸（图2）。

2. 2 TcMCT蛋白的生物信息学分析结果

ExPASy预测结果显示，TcMCT蛋白的相对分子质量为34.3 kD，pI为8.96。将TcMCT（AGP04988.1）与银杏GbMCT（AAZ80386.1）、青蒿AaMCT（KU 365210.1）、拟南芥AtMCT（NP_565286.1）和丹参SmMCT（AEZ55666.1）进行氨基酸序列多重比对分析，结果（图3）显示，TcMCT蛋白与其他植物MCT蛋白中均含有保守的MEP结合位点和CTP结合位点，但在N端氨基酸序列保守性较差。系统发育进化树分析结果（图4）显示，MCT蛋白可分为五大类群，即双子叶植物、单子叶植物、裸子植物、藻类植物和菌类，各类群物种的MCT蛋白亲缘关系最近，其中，TcMCT蛋白与同为裸子植物的银杏GbMCT蛋白的亲缘关系最近，氨基酸序列的相似性为59.3%。通过蛋白三级结构的同源性建模发现，TcMCT与AtMCT蛋白均属于同源二聚体（图5），且CTP结合位点位置相似，分别为Arg103～Lys110和Arg91～Lys98，MEP结合位点位置也相似，分别为Arg240～Lys296和Arg228～Lys284，表明二者可能具有相似的生物学功能。

2. 3 TcMCT蛋白的亚细胞定位结果

ChloroP预测结果显示，TcMCT蛋白的N端含有84个氨基酸残基的质体转运肽（图2黑色下划线），且以Arg88作为切割位点，与AtMCT转运肽切割位点相同（Xiao et al.，2009）。将含TcMCT蛋白质体转运肽编码核苷酸序列（TP）的重组质粒pCAMBIA1300-TP-GFP转化至烟草原生质体中，结果发现，TcMCT蛋白的质体转运肽和GFP融合蛋白在488 nm波长激发光下发射绿色荧光（图6-A），烟草叶绿体在555 nm波长激发光下发射红色荧光（图6-B），且两种荧光能完全重叠呈黄色荧光（图6-C），表明TcMCT蛋白定位于叶绿体中。

2. 4 TcMCT基因的组织表达特性分析結果

从图7可知，TcMCT基因在南方红豆杉不同组织中均有表达，但表达水平存在明显差异，TcMCT基因在绿色树皮中的相对表达量显著高于其他组织（P<0.05，下同），且在老叶和嫩叶中的相对表达量显著高于茎和根，在茎和根中的表达量极少甚至不表达，说明TcMCT基因在南方红豆杉中的表达具有组织特异性。

2. 5 TcMCT基因功能验证结果

将pTrc-TcMCT与pAC-BETA共转染大肠杆菌XL1-Blue后涂布于含氯霉素和氨苄霉素的LB固体培养基上，28 ℃培养2 d，阳性克隆呈橘黄色，挑取阳性克隆扩大培养后涂布于含0.1 mmol/L IPTG、氯霉素和氨苄霉素的LB固体培养基上，28 ℃培养2 d后发现菌落仍呈橘黄色。该结果与阳性对照（pTrc-AtMCT与pAC-BETA共转染大肠杆菌XL1-Blue）中的结果一致。阴性对照中，仅pTrc和pAC-BETA共转染的大肠杆菌能在双抗LB固体培养基上生长，但菌体颜色呈白色，其原因是无MCT基因表达或表达量过低，无法合成β-胡萝卜素。可见，大肠杆菌中超表达TcMCT基因可促进β-胡萝卜素大量积累，推测TcMCT与AtMCT基因对萜类化合物的合成发挥相似的生物学功能（Rohdich et al.，2006）。

3 讨论

本研究利用同源克隆技术从南方红豆杉绿色树皮中克隆获得TcMCT基因cDNA全长序列，其编码蛋白N端含84个氨基酸残基的质体转运肽，以Arg88为切割位点，与拟南芥AtMCT蛋白的切割位点相同（Rohdich et al.，2000;Xiao et al.，2009）。此外，TcMCT蛋白的三级结构与AtMCT蛋白相似，均为同源二聚体，且MEP结合位点和CTP结合位点位置也相似，推测TcMCT蛋白具有与AtMCT蛋白一样的催化活性（Rohdich et al.，2000）。本研究亚细胞定位结果显示，TcMCT蛋白定位于叶绿体中，与同为裸子植物的银杏GbMCT转运肽定位情况（Kim et al.，2006）一致，也与紫杉醇前体合成定位于质体（Eisenreich et al.，1996）和MEP途径定位于质体（Botella-Pavia et al.，2004;Kim et al.，2006）的事实相符，暗示裸子植物MCT蛋白氨基酸序列的保守性较高，具有相似的生物学功能。

紫杉醇和青蒿素等萜烯物质的生物合成途径包括MEP途径（Towler and Weathers，2007;陆锦池等，2009）。其中，青蒿素的生物合成及积累主要场所为青蒿分泌型腺毛（Olofsson et al.，2012）。张曼等（2016）也曾研究发现，AaMCT基因在青蒿分泌型腺毛中高表达，在其他组织中低表达。紫杉醇在红豆杉属植物树皮中合成并积累（Ang et al.，2012;Zheng et al.，2016）。刘万宏（2008）研究发现，曼地亚红豆杉TmMECT基因在曼地亚红豆杉绿色树皮中的表达量较高，但在根和茎中的表达量较低。由此可见，不同物种的MCT基因组织表达特异性与其萜烯生物合成部位相吻合。本研究也发现，TcMCT基因在南方红豆杉绿色树皮中的表达量最高，说明紫杉醇生物合成主要发生在南方红豆杉绿色树皮中。Liu等（2009）、王辉等（2018）研究发现，大肠杆菌中超表达紫杉醇生物合成中MEP途径的基因能促进β-胡萝卜素的积累，菌落呈橘黄色。本研究将pAC-BETA和pTrc-TcMCT共转染大肠杆菌XL1-Blue后发现，菌落也呈橘黄色，表明大肠杆菌中超表达TcMCT基因可促进β-胡萝卜素大量积累，与上述前人研究结果一致。可见，TcMCT基因在宿主菌中高效表达，推动萜类代谢向β-胡萝卜素合成方向的流动，促进萜类化合物β-胡萝卜素积累，进一步证实MCT催化MEP和CDP合成CDP-ME的过程对于萜类物质的生物合成至关重要。在今后可通过构建TcMCT超表达载体获得超表达TcMCT基因的南方红豆杉转基因株系，进一步研究MCT在紫杉醇生物合成途径中的分子机制，为探究紫杉醇生物合成调控提供新的候选基因。

4 结论

不同物种的MCT氨基酸序列具有较高保守性，TcMCT基因具有明显的组织表达特异性，可调控萜类物质如β-胡萝卜素等的生物合成，推测TcMCT基因在紫杉醇生物合成中发挥重要调控作用。

参考文献：

董宇茹，苏平，张萌，赵瑜君，王秀娟，高伟，黄璐琦. 2015. 雷公藤MCT基因的全长克隆与表达分析[J]. 中国中药杂志，40（22）：4378-4383. [Dong Y R，Su P，Zhang M，Zhao Y J，Wang X J，Gao W，Huang L Q. 2015. Cloning and expression analysis of 2-C-methyl-D-erythritol 4-phosphate cytidylyltransferase gene in Tripterygium wilfordii[J]. China Journal of Chinese Materia Medica，40（22）：4378-4383.]

刘攀峰. 2012. 杜仲MEP途径系列基因全长cDNA分离鉴定及序列特征研究[D]. 北京：中国林业科学研究院. [Liu P F. 2012. Isolation，identification and sequence characteri-zation of full length cDNA of MEP pathway related genes in Eucommia ulmoides[D]. Beijng：Chinese Academy of Forestry.]

刘万宏. 2008. 紫杉醇前体合成途径两个关键酶基因克隆和分析[D]. 重庆：西南大学. [Liu W H. 2008. Cloning and characterization of two key enzyme genes involved in the biosynthesis pathway of taxol precursors[D]. Chong-qing：Southwest University.]

陆锦池，陈荣山，刘长辉，叶陈英，王海斌，何海斌. 2009. 浅述植物萜类物质的生物合成途径[J]. 农业科技通讯，（3）：78-80. [Lu J C，Chen R S，Liu C H，Ye C Y，Wang H B，He H B. 2009. The review of the terpenoid biosynthesis pathway in plant[J]. Agricultural Technology Communication，（3）：78-80.]

宋雅迪，赵瑜君，陈上，胡添源，张睿，王家典，卢鋆，王秀娟，高伟，黄璐琦. 2018. 雷公藤MCT基因RNAi对雷公藤萜类活性成分生物合成的影响[J]. 药学学报，53（8）：1209-1214. [Song Y D，Zhao Y J，Chen S，Hu T Y，Zhang R，Wang J D，Lu J，Wang X J，Gao W，Huang L Q. 2018. Effect on biosynthesis of terpenoid active components through RNA interference with MCT gene in Tripterygium wilfordii[J]. Acta Pharmaceutica Sinica，53（8）：1209-1214.]

王辉，冯国庆，李忠玥，邱飞，兰小中，廖志华，杨春贤. 2018. 南方红豆杉DXS基因的克隆与功能分析[J]. 中草药，49（19）：4636-4643. [Wang H，Feng G Q，Li Z Y，Qiu F，Lan X Z，Liao Z H，Yang C X. 2018. Molecular cloning and characterization of 1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate synthase gene from Taxus chinensis[J]. Chinese Traditional and Herbal Drugs，49（19）：4636-4643.]

吴继刚. 2015. 南方红豆杉的特性与种植技术[J]. 农业与技术，35（20）：122. [Wu J G. 2015. Characteristics and plan-ting techniques of Taxus chinensis[J]. Agriculture and Technology，35（20）：122.]

張曼，向礼恩，王辉，兰小中，陈敏，廖志华. 2016. 青蒿2-C-甲基-D-赤藓醇-4-磷酸胱氨酰转移酶基因克隆与分析[J]. 药学学报，51（8）：1334-1339. [Zhang M，Xiang L E，Wang H，Lan X Z，Chen M，Liao Z H. 2016. Molecular cloning and characterization of the 2-C-methyl-D-erythritol 4-phosphate cytidylyltransferase gene from Artemisia annua L.[J]. Acta Pharmaceutica Sinica，51（8）：1334-1339.]

张甜甜，李锐，陈晓仪，赵琦. 2018. 卷叶贝母MCT基因克隆与表达分析[J]. 分子植物育种，16（22）：7275-7280. [Zhang T T，Li R，Chen X Y，Zhao Q. 2018. Cloning and expre-ssion analysis of MCT gene in Fritillaria cirrhosa D. Don[J]. Molecular Plant Breeding，16（22）：7275-7280.]

郑玉娟，陈容，周文华. 2014. 胡黄连2-C-甲基-D-赤藓糖-4-磷酸胞苷转移酶基因的生物信息学分析[J]. 中草药，45（15）：2218-2223. [Zheng Y J，Chen R，Zhou W H. 2014. Bio-informatics analysis of 2-C-methyl-D-erythritol 4-phosphate cytidylytransferase gene in Picrorhiza kurrooa[J]. Chinese Traditional and Herbal Drugs，45（15）：2218-2223.]

Ang E S，Pavlos N J，Chim S M，Feng H T，Scaife R M，Steer J H，Zheng M H，Xu J K. 2012. Paclitaxel inhibits osteoclast formation and bone resorption via influencing mitotic cell cycle arrest and RANKL-induced activation of NF-κB and ERK[J]. Journal of Cellular Biochemistry，113（3）：946-955.

Armstrong D K，Bundy B N，Wenzel L，Huang H Q，Baergen R N，Lele S，Copeland L J，Walker J L，Burger R A. 2006. Intraperitoneal cisplatin and paclitaxel in ovarian cancer[J]. The New England Journal of Medicine，354（1）：34-43.

Botella-Pavia P，Besumbes O，Phillips M A，Carretero-Paulet L，Boronat A，Rodríguez-Concepción M. 2004. Regulation of carotenoid biosynthesis in plants：Evidence for a key role of hydroxymethylbutenyl diphosphate reductase in controlling the supply of plastidial isoprenoid precursors[J]. The Plant Journal，40（2）：188-199.

Croteau R，Ketchum R E，Long R M，Kaspera R，Wildung M R. 2006. Taxol biosynthesis and molecular genetics[J]. Phytochemistry Reviews，5（1）：75-97.

Eisenreich W，Menhard B，Hylands P J，Zenk M H，Bacher A. 1996. Studies on the biosynthesis of taxol the taxane carbon skeleton is not of mevalonoid origin[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，93（13），6431-6436.

Gao S，Lin J，Liu X F， Deng Z X，Li Y J，Sun X F，Tang K X. 2006. Molecular cloning，characterization and functional analysis of a 2-C-methyl-D-erythritol 2，4-cyclodiphosphate synthase gene from Ginkgo biloba[J]. Journal of Biochemistry & Molecular Biology，39（5）：502-510.

Kim S，Kuzuyama T，Chang Y J，Kwon H，Kim S. 2006. Cloning and functional characterization of 2-C-methyl-D-erythritol 4-phosphate cytidyltransferase（GbMECT） gene from Ginkgo biloba[J]. Phytochemistry，67（14）：1435-1441.

Liu W H，Chen M，Yang C X，Yang Y J，Lan X Z，Liao Z H. 2009. A new 2-C-methyl-D-erythritol 2，4-cyclodiphosphate synthase gene from Taxus media：Cloning，characterization and functional complementation[J]. Journal of Medicinal Plants Research，3（5）：395-402.

Miller K D，Wang M，Gralow J R，Dickler M N，Cobleigh M A，Perez E A，Shenkier T，Cella D，Davidson N E. 2007. Paclitaxel plus bevacizumab versus paclitaxel alone for metastatic breast cancer[J]. The New England Journal of Medicine，357（26）：2666-2676.

Olofsson L，Lundgren A，Brodelius P E. 2012. Trichome isolation with and without fixation using laser microdissection and pressure catapulting followed by RNA amplification：Expression of genes of terpene metabolism in apical and sub-apical trichome cells of Artemisia annua L.[J]. Plant Science，183：9-13.

Oudin M J，Barbier L，Schäfer C，Kosciuk T，Miller M A，Han S J，Jonas O，Lauffenburger D A，Gertler F B. 2017. Mena confers resistance to paclitaxel in triple-negative breast cancer[J]. Molecular Cancer Therapeutics，16（1）：143-155.

Rezazadeh M，Emami J，Hasanzadeh F，Sadeghi H，Minaiyan M，Mostafavi A，Rostami M，Lavasanifar A. 2016. In vivo pharmacokinetics，biodistribution and anti-tumor effect of paclitaxel-loaded targeted chitosan-based polymeric micelle[J]. Drug Delivery，23（5）：1707-1717.

Rohdich F，Lauw S，Kaiser J，Feicht R，Kohler P，Bacher A，Eisenreich W. 2006. Isoprenoid biosynthesis in plants 2-C-methyl-D-erythritol-4-phosphate synthase（IspC protein） of Arabidopsis thaliana[J]. FEBS Journal，273（19）：4446-4458.

Rohdich F，Wungsintaweekul J，Eisenreich W，Richter G，Schuhr C A，Hecht S，Zenk M H，Bacher A. 2000. Biosynthesis of terpenoids：4-diphosphocytidyl-2-C-methyl-D-erythritol synthase of Arabidopsis thaliana[J]. Procee-dings of the National Academy of Sciences of the United States of America，97（12）：6451-6456.

Rohdich F，Wungsintaweekul J，Fellermeier M，Sagner S，Herz S，Kis K，Eisenreich W，Bacher A，Zenk M H. 1999. Cytidine 5'-triphosphate-dependent biosynthesis of isoprenoids：YgbP protein of Escherichia coli catalyzes the formation of 4-diphosphocytidyl-2-C-methylerythritol[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，96（21）：11758-11763.

Soliman S，Greenwood J S，Bombarely A，Mueller L A，Tsao R，Mosser D D，Raizada M N. 2015. An endophyte constructs fungicide-containing extracellular barriers for its host plant[J]. Current Biology，25（19）：2570-2576.

Suire C，Bouvier F，Backhaus R A，Begu D，Bonneu M，Camara B. 2000. Cellular localization of isoprenoid biosynthe-tic enzymes in Marchantia polymorpha uncovering a new role of oil bodies[J]. Plant Physiology，124（3）：971-978.

Towler M J，Weathers P J. 2007. Evidence of artemisinin production from IPP stemming from both the mevalonate and the nonmevalonate pathways[J]. Plant Cell Reports，26（12）：2129.

Xiao Y L，Zahariou G，Sanakis Y，Liu P H. 2009. IspG enzyme activity in the deoxyxylulose phosphate pathway：Roles of the iron-sulfur cluster[J]. Biochemistry，48（44）：10483-10485.

Yoo S，Cho Y H，Sheen J. 2007. Arabidopsis mesophyll protoplasts：A versatile cell system for transient gene expre-ssion analysis[J]. Nature Protocols，2（7）：1565-1572.

Zheng X H，Li Z S，Chen L，Xie Z G，Jing X B. 2016. Self-assembly of porphyrin-paclitaxel conjugates into nanomedicines：Enhanced cytotoxicity due to endosomal escape[J]. Chemistry，an Asian Journal，11（12）：1780-1784.

（責任编辑 陈 燕）