一款胚芽为核心的八宝粥的营养成分分析及体外活性评价

韩晓峰 王成祥 文剑 马芙俊 马淑红 段盛林

摘 要：研究了一款以胚芽为核心的八宝粥的营养成分和抗氧化性能力，以及胚芽球蛋白对RAW 264.7巨噬细胞的增殖作用。首先测定了此款八宝粥的各种氨基酸含量，重点考察了γ-氨基丁酸（GABA）的含量;其次分别采用还原Fe3+、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）法、邻苯三酚自氧化法和Folin-Ciocalteu法测定了该产品的总还原力、DPPH自由基清除能力、超氧阴离子自由基清除能力和总多酚的含量;最后分离提取出胚芽球蛋白，并且通过细胞实验分析球蛋白对巨噬细胞的增殖能力。结果表明：该产品氨基酸含量丰富，尤其是GABA含量比较突出，该产品具有很好的抗氧化能力;巨噬细胞的增殖实验表明，该产品具有提高机体的免疫能力的潜力。

关键词：八宝粥;胚芽;营养成分;抗氧化性;巨噬细胞增殖

粥作为商品化的食品形式，往往被打上“快消品”和添加较多防腐剂、稳定助剂的标签[1-4]，我们研究团队在前期的工作中已经成功解决了以胚芽为核心的八宝粥（下称胚芽粥）的稳定性问题[5]，在不添加助剂的情况下能够形成自稳定体系[6]，并且以玉米胚芽和小麦胚芽为核心原料，对食材中的糙米、绿豆和鹰嘴豆进行发芽处理，达到强化重点营养素的目的，同时口感和风味优于对比产品。本研究在解决稳定性和适口性的基础上，通过分析检测和功能评价进一步考察胚芽粥的营养成分和抗氧化能力。巨噬细胞是机体非特异性免疫的重要组成[7]，球蛋白是胚芽中的主要蛋白之一，植物中的球蛋白具有免疫调节作用[8]。本研究通过细胞实验评价了胚芽球蛋白对巨噬细胞的增殖能力。

1 材料和试剂

1.1 原料与试剂

1.1.1 胚芽粥原辅料 玉米胚芽粉、小麦胚芽粉、鹰嘴豆、绿豆、糙米、胡萝卜、玉米粒、糯米、普通大米、魔芋粉、木糖醇、燕麦纤维、低聚果糖和变性淀粉，同福碗粥股份有限公司;品牌A燕麦粥、品牌B燕麦粥，超市购买。

1.1.2 试剂 福林试剂、磷酸缓冲盐溶液（PBS）、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、γ-氨基丁酸标准品、Tris-HCl、Folin-Ciocalteu试剂、氨基乙酸Glycine、考马斯亮蓝，美国Sigma化学公司;重蒸苯酚、次氯酸钠、无水乙醇、铁氰化钾、三氯化铁、三氯乙酸、浓盐酸、碳酸钠、没食子酸、氯化钠、正己烷、亚硫酸、硫酸铵，国药集团化学试剂有限公司，分析纯;十二烷基磺酸钠（SDS）、丙烯酰胺（Acr）、N-N甲叉双丙烯酰胺（Bis）、四甲基乙二胺（TEMED）、β-巯基乙醇，北京鼎国生物技术有限责任公司;蒸馏水，屈臣氏;DMEM培养基、噻唑兰（MTT）、胰蛋白酶、平衡盐缓冲液（HBSS），太和华美（北京）医药科技股份有限公司;胎牛血清（FBS），北京北方同正生物技术发展有限公司;无FFA牛血清蛋白（BSA），日本WAKO公司;Western 洗膜盒、TME显色液，碧云天生物技术有限公司;RAW 264.7巨噬细胞，中国医学科学院基础医学研究所基础医学细胞中心。

1.2 仪器与设备

微量移液枪，德国Eppendorf 公司;RE-52A 旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器有限公司;pH计、精密电子天平CP214，瑞士Mettler Toledo 公司;759-紫外可见分光光度计，上海菁华科技仪器有限公司;DK-8D三温三控水槽，上海博迅实业有限公司;KQ-250DE数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司;SHA-B水浴恒温振荡器，金坛市精达仪器制造厂;SHZ（III）循环水式真空泵，河南省予华仪器有限公司;LGJ-18真空冷冻干燥机，北京松源华兴科技发展有限公司;全波长酶标仪，美国热电集团;高速冷冻离心机，美国贝克曼公司;凝胶色谱系统1525型，沃特世科技（上海）有限公司;全自动氨基酸分析仪L-8900，株式会社日立制作所;凝胶成像仪QUANTUM VILBER LOURMAT，北京五洲东方科技发展有限公司;赛洛捷克 Scilogex MX-F固定式旋涡混合器、掌上离心机Scilogex D1008&D1008E，北京言必信有限公司;电泳槽Biorad Mini-PROTEAN Tetra Cells，伯乐BIO-RAD;脱色摇床 WD-94056D，北京市六一仪器厂;医用低温保存箱（-80℃）DW-86L728J，青岛海尔特种电器有限公司。

2 胚芽粥的制备

2.1 胚芽粉的制备

选取小麦胚芽和玉米胚芽按比例混合，经过清洗、脱硫、提取、酶解、过滤、浓缩、杀菌、喷雾干燥，最终得到成品原料胚芽粉（图1）。

2.2 鹰嘴豆、绿豆和糙米的发芽处理

鹰嘴豆、绿豆和糙米清洗沥干后用0.2mol/L的次氯酸钠溶液消毒25min，再次冲洗。鹰嘴豆、绿豆和糙米加入水，没过1cm。35℃水浴锅恒温水浴10～24h，5～6h换1次水，冲洗3次。经过浸泡，有明显的小芽冒出后，水冲洗3次，纱布覆盖，加入少量水，保持湿润，在35℃水浴中发芽10～12h。

2.3 胚芽粥的制备工艺

將鹰嘴豆、绿豆和糙米进行发芽处理后，胡萝卜切丁备用，将所有原料搅拌均匀，备用。将木糖醇、燕麦纤维等配制成糖液。填量300g/碗，封口温度≥175℃。将灌装好的半成品放入杀菌锅，121℃高温杀菌40min（图2）。

3 实验方法

3.1 受试物制备

3.1.1 胚芽粥原料的水提取物制备方法 将未发芽和发芽后的绿豆和糙米分别粉碎，室温晾干，再次粉碎，过60目筛，粉末备用。检测前分别取待测粉末，称量2.5g，加适量蒸馏水研磨匀浆，然后定容至50mL，30℃水浴中浸提2h，抽滤，冻干机干燥。

3.1.2 胚芽粥与对比产品处理方法 取6g胚芽粥和其他样品，加适量蒸馏水研磨均匀，然后定容到50mL，于30℃水浴浸提2h抽滤，冻干机干燥。

3.2 产品营养素分析

3.2.1 原料和胚芽粥中γ-氨基丁酸（GABA）含量测定 按照吴波等[9]的测定方法，于645 nm波长处测定其吸光度。取准确配制好的0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6mg/mL的GABA标准溶液测定其吸光度，以GABA浓度为横坐标、以吸光度为纵坐标，绘制标准曲线（图3）。

3.2.2 胚芽粥氨基酸含量的测定 依据“GB/T 5009. 124—2003 食品中氨基酸的测定”方法。

3.3 抗氧化性能测定

3.3.1 总还原能力的测定 按照测定方法[10]，分别加入1mL pH 6.6的0.2 mol/L PBS 缓冲液、1mL 1%铁氰化钾溶液、1mL提取样液于试管中，摇匀后置于50℃水浴中加热20min，待冷却后再加入1mL 10%三氯乙酸溶液并摇匀，离心（3 000r/min，10min）;吸取2mL于另一只试管中，加入3mL蒸馏水和0.2mL 0.1%三氯化铁溶液，混匀后静置10min，于700nm处测定反应体系的OD值，以蒸馏水为参照。

3.3.2 DPPH自由基清除率的测定 按照本课题组的测定方法[10]，称取0.007 9g DPPH 用无水乙醇溶解，定容至100mL。 按照表1加样后，避光反应30min，利用紫外-可见分光光度计法在波长517 nm处测定吸光值，以吸收的下降表示其对有机自由基消除能力。统一蒸馏水做空白。

3.3.3 超氧阴离子自由基清除能力的测定 采用邻苯三酚自氧化法，测定发芽糙米中的超氧阴离子自由基的清除能力，以此代表抗氧化活性：在2.4mL Tris-HCl缓冲液（pH值8.2）中加入0.1mL提取液，混匀后加入0.3mL浓度为7mmol/L的邻苯三酚开始反应，4min时加入1滴浓度为10mol/L的浓盐酸终止反应，随后在波长325nm处测定体系的吸光度（A1）。对超氧阴离子自由基的清除能力用TR表示，计算公式为式（1）：

TR=（A0-A1）/A0×100%（1）

式（1）中：A0—空白管的吸光度。

3.3.4 总多酚含量的测定

（1）标准溶液配制：准确称取0.5g没食子酸，溶于40mL蒸馏水中，定容到100mL。再用配好的溶液1mL稀释至100mL，即为浓度为0.05mg/mL没食子酸标准溶液。

（2）样品测定：采用Folin-Ciocalteu方法进行测定。

（3）标准曲线的制作：准确吸取多酚标准溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL于10.0mL容量瓶中，各加6.0mL水，摇匀。加入0.5mL福林试剂，充分摇匀，1min后加20%的Na2CO3溶液1.5mL，摇匀，用去离子水定容至10.0mL，70℃水浴加热10min，冷却后在765nm下测定吸光度，以没食子酸浓度为横坐标、以吸光度为纵坐标，绘制标准曲线（图4）。

3.4 胚芽球蛋白的分离及鉴定

3.4.1 胚芽球蛋白的提取 依据朱科学等[11]的提取方法，取胚芽粉以1∶8的重量比加入正己烷，摇床常温搅拌12h，静止0.5h弃去上清液，沉淀用旋转蒸发仪除去有机试剂，得到脱脂胚芽粉。准确称取一定量脱脂胚芽粉，按1∶5重量比加入去离子水，室温下搅拌30min、3 000 r/min离心15min，弃去上清液;重复此操作1次;向沉淀中加入1L 3% NaCl溶液，室温下搅拌浸提30min，3 000r/min离心15min，收集上清液;继而加 500mL 3% NaCl溶液于沉淀中，进行相同的操作，收集上清液。将2次所得的上清液合并，边搅拌边加入饱和硫酸铵溶液至溶液半饱和;3 000 r/min离心15min，弃去上清液取沉淀，沉淀用去离子水分散;3 000r/min离心15min，用去离子水洗涤沉淀，相同条件离心，获得的沉淀置于培养皿中，冷冻干燥即为胚芽球蛋白，实验备用。

3.4.2 电泳测定 制胶：将分离胶混匀后灌入玻璃板间，以水封顶，保持液面水平，倒弃分离胶上的水，并用滤纸吸干多余水分，加入上浓缩胶，立即将梳子插入玻璃板间。15～30min完全聚合后，小心拔出梳子，然后将玻璃板固定在电泳槽上。样品前处理：将样品配制成溶液加入5×SDS上样缓冲液（4∶1 体积比），100℃加热3～5min，12 000g离心1min，取上清作SDS-PAGE分析。上样：取15μL样品加入样品池，并加入Marker。电泳：浓缩胶电压80 V，分离胶电压120 V，电泳至溴酚蓝行至电泳槽下端停止。染色：将胶从玻璃板中取出，置于考马斯亮蓝染色液中染色，脱色摇床上室温染色1h。脱色：将胶从染色液中取出，放入脱色液中，更换3～4次脱色至蛋白带清晰。凝胶可保存于双蒸水中或7%乙酸溶液中。

3.5 胚芽球蛋白巨噬细胞增殖实验

取生长良好、对数生长期的RAW 264.7巨噬細胞，PBS洗3次，胰酶消化后进行计数，调整细胞浓度为105个/mL，接种于96孔板，每孔200μL，置于5% CO2 37℃的培养箱培养，待细胞贴壁后吸弃培养上清液，PBS洗去未贴壁细胞，分别加入100μL DMEM培养基（含10% FBS）和不同浓度胚芽球蛋白（0.1～1 000μg/mL）。每组设6个复孔，置于5% CO2 37℃的培养箱中培养，24h后吸弃孔内培养液，换成100μL无血清DMEM培养基，每孔加50μL MTT（2mg/mL），继续培养4h后，吸弃孔内培养液，每孔加入150μL DMSO，于振荡仪振荡10min后，使用酶标仪测490nm下的各孔OD值。独立批次细胞实验重复3次。

4 结果与分析

4.1 产品营养素分析结果

4.1.1 GABA含量

由图5可知，糙米和绿豆发芽后其GABA含量都有所提高，其中绿豆发芽和未发芽GABA含量都高于糙米。总体来看，发芽能够一定程度提高糙米和绿豆中GABA的含量。

4.1.2 氨基酸测定 从表2、图6中可知，胚芽粥中含有18种氨基酸，蛋白含量为0.93g/100g。胚芽粥中含有人体必需的8种必需氨基酸：Thr（0.030 4%）、Val（0.047 7%）、Met（0.017 4%）、Ile（0.032 8%）、Leu（0.082 5%）、Phe（0.050 1%）、Lys（0.046 6%）、Trp（0.011 3%）。由此可见，胚芽粥中的氨基酸组成丰富。

4.2 抗氧化实验结果

4.2.1 总还原能力的测定 还原力强弱与抗氧化性溶液浓度呈正相关性，即样品提取物浓度越大，则吸光值越大，进而可知其还原力越大。由图7可知，发芽后糙米、绿豆的还原能力较未发芽时都有所提高，其中绿豆提高比较明显。胚芽粥相比于普通大米粥、品牌A燕麦粥、品牌B燕麦粥的总还原能力要高，说明发芽有助于提高原料的抗氧化能力。

4.2.2 DPPH自由基清除率的测定 根据DPPH自由基的单电子在517 nm处有一强吸收，其醇溶液呈紫色的特性。由于自由基清除剂能够与单电子配对而使得吸收逐渐消失，因此，褪色程度越大，样品中自由基清除剂越多，抗氧化能力越好。由图8可知，发芽糙米的DPPH清除能力较未发芽时要强，绿豆发芽前后的DPPH清除能力没有很大差异。同时，胚芽粥相比于普通大米粥、品牌A燕麦粥、品牌B燕麦粥的DPPH清除能力要高，说明发芽有助于提高原料的抗氧化能力。

4.2.3 超氧阴离子自由基清除能力的测定 未发芽糙米和未发芽绿豆总多酚对超氧阴离子的清除率分别低于发芽糙米和发芽绿豆，这表明，发芽后糙米、绿豆增加的多酚物质的抗氧化活性与其含量具有正相关性，发芽后抗氧化能力增强。相比于普通大米粥、品牌A燕麦粥、品牌B燕麦粥，胚芽粥的超氧阴离子的清除率要高，说明以发芽原料制得的粥的抗氧化能力会增强（图9）。

4.2.4 总多酚含量的测定 由图10可知，经过35℃发芽处理后，糙米、绿豆的总多酚含量分别提高2.01、1.29mg/100g。说明发芽处理有利于糙米、绿豆总多酚含量的提高。并且，相比于普通大米粥、品牌A燕麦粥、品牌B燕麦粥，胚芽粥的总多酚含量要高，说明以发芽原料制得的粥的抗氧化能力会增强。

4.3 胚芽球蛋白的鉴定结果

图11结果表明，电泳的4条泳道分别为不同浓度的球蛋白提取物，1～2为1、0.5mg/mL的样品浓度，3～4均为0.25mg/mL的样品浓度。研究表明，球蛋白主要由4条亚基组成，2条轻链、2条重链。2条轻链的分子量约为250kD，2条重链的分子量约为500、700kD[12]。球蛋白提取物的分子量主要集中在200、400、550、700kD左右，其中在550kD和700kD處的条带较为清晰。电泳图谱中可明显看出，除了主要条带外还有其他亚基，说明提取的球蛋白提取物主要为球蛋白，其中可能参杂了少量的清蛋白或者谷蛋白。为了验证提取的球蛋白是否具有免疫活性，对球蛋白的提取物进行进一步的体外免疫活性验证。

4.4 胚芽球蛋白巨噬细胞增殖实验

图12结果表明，不同浓度的免疫球蛋白均能够促进巨噬细胞RAW 264.7的增殖，质量浓度为1、0.1、0.01mg/mL时，巨噬细胞RAW 264.7的增殖呈现显著性差异（P<0.05）。当免疫球蛋白的质量浓度为1mg/mL时，促进巨噬细胞RAW 264.7增殖的作用最大（P<0.01）;当其浓度为0.001、0.000 1mg/mL时，促进巨噬细胞RAW 264.7的增殖作用不显著（P>0.05）。由此可知，在一定浓度范围内，随着免疫球蛋白的浓度的增大，促进巨噬细胞增殖的作用越强。

5 结论

糙米、绿豆、鹰嘴豆的发芽使得食材所含有的大量酶被激活和释放，在酶解作用下释放出更多营养成分，降低甚至消除抗营养因子[13]，并且糙米发芽能够软化糠层纤维，达到提升口感和风味的效果[14]。本文通过实验证实，发芽工艺大幅提高了GABA的含量[15]，同时也表明胚芽粥含有多种氨基酸。本文通过抗氧化体系实验研究发现，胚芽粥具有很好的抗氧化能力，胚芽球蛋白可能通过增强巨噬细胞的增殖能力来提高机体的免疫能力。

参考文献

[1]周宇.中国粥文化漫谈 [J].食品与生活，2002（3）：28-29.

[2]于惠中.早餐吃碗“八宝粥”[J].科学养生，2009（5）：9.

[3]蒋海鹏.罐头食品的近况、技术进展和存在的问题分析 [J].科技创新导报，2014，11（4）：50.

[4]杨长志，等.UPLC-MS-MS法测定八宝粥罐头中乙二胺四乙酸二钠残留量 [J].食品科学，2015，36（4）：208-212.

[5]王雪，段盛林，刘辉，等.一款胚芽八宝粥的智能感官以及稳定性评价[J].食品与发酵工业，2017，43（2）：215-219.

[6]郑海平，申利娟.碗装八宝粥稳定性的影响因素研究 [J].食品工业，2012（5）：60-62.

[7]杨春青，薛庆节，白波.巨噬细胞对凋亡细胞的吞噬与免疫调节 [J].现代免疫学，2017（4）：350-353.

[8]Imogen Sparkes.Recent advances in understanding plant myosin function：life in the fast lane [J].Molecular Plant，2011，4（5）：805.

[9]吴波，等.酿酒酵母菌的分离培养及其GABA含量的测定 [J].黑龙江畜牧兽医，2016（16）：176-177.

[10]贾福怀，韩晓峰，马芙俊，等.一款“肽植”固体饮料的体外活性和对斑马鱼肝脏保护作用的评价 [J].食品与发酵工业，2018（1）：98-103.

[11]朱科学，等.小麦胚芽球蛋白的提取及功能性质研究 [J].中国粮油学报，2008，23（5）：19-23.

[12]刁大鹏，黄继红，李锦，等.小麦胚芽球蛋白提取工艺及分子质量测定 [J].河南工业大学学报（自然科学版），2013，34（2）：52-55.

[13]肖俊松，等.鹰嘴豆萌发过程中营养成分和抗营养因子的变化规律 [J].食品科学，2011，32（23）：134-138.

[14]Ssikusa，T.，et al.Distribution of free amino acids in the rice kernel and kernel fractions and the effects of water soaking on the distribution [J].Agri.Food Chem.，1994（42）：1122-1125.

[15]鄭丽娜，赵莹.绿豆发芽过程中营养成分的变化 [J].食品科学，2008（2）：125-128.

Nutrient Ingredients Analysis and in Vitro Activity Evaluation on A Mixed Germ Congee

HAN Xiao-feng1，2，WANG Cheng-xiang3，WEN Jian1，2，MA Fu-jun1，2，MA Shu-hong3，DUAN Sheng-lin1，2

（1 China National Research Institute of Food & Fermentation Industries，Beijing 100015，China;2 Functional Staple Food Creation and Nutrition Intervention for Chronic Diseases in Beijing Key Laboratory，Beijing 100015，China;3 Tong-fu Porridge Limited by Share Ltd，Wuhu 241000，China）

Abstract：Objective To analyze nutrient ingredients and the antioxidant capacity of a kind of mixed congee with germ，and study the proliferative effect of the germ globulin to the macrophage RAW 264.7 in vitro.Method First of all，the amino acid contents in this product was measured，and the γ-aminobutyric acid（GABA）was investigated among all key materials，the congee and other contrastive products.Secondly，the antioxidant activities of this congee and related substrates was determined by Fe3+reducing power，the scavenging ability of DPPH free radical，the eliminating capacity of superoxide anion radical and the contents of total polyphenols.Whats more，the proliferative activity of the germ globulin to the macrophage RAW 264.7 was determined via cells experiment in vitro.Result The germ congee was not only a kind of nutrition-rich food，which was packed with amino acids and GABA，but also had the potential to boost the body immunity.Conclusion This work is worth to continue to study further.

Keywords：mixed congee;germ;nutrient ingredient;antioxidant activity;macrophages proliferation

（责任编辑 唐建敏）