日粮添加玉米粉与油脂对奶牛乳品质及瘤胃细菌菌群变化的影响

郭成 吉武龙 李娜 付子琳 张力莉 徐晓锋

摘 要：【目的】闡释日粮添加玉米粉与油脂诱导奶牛低乳脂情况下，奶牛瘤胃细菌菌群的变化情况。【方法】采用自身对照试验设计，选取4头体况相近、健康的泌乳期中国荷斯坦奶牛。试验开始前先以基础日粮预饲并以自身作对照。试验期奶牛日粮中添加玉米粉1.5 kg·头-1·d-1，添加胡麻油150 mL·头-1·d-1。预饲期为7 d，试验期为15 d，分析奶牛乳脂率及瘤胃细菌菌群变化情况。【结果】在饲料淀粉营养水平达到27%左右水平上额外添加胡麻油150 mL·头-1·d-1，连续添加15 d使奶牛的乳脂率极显著降低（P<0.01），乳糖显著升高（P<0.05），成功诱导奶牛乳脂降低。瘤胃细菌研究表明，在门水平上共检测到29个菌门，与对照组相比，玉米粉和油脂诱导乳脂降低后奶牛瘤胃导软壁菌门丰度显著降低（P<0.05），放线菌门与浮霉菌门丰度极显著增加（P<0.01）;螺旋菌门丰度显著增加（P<0.05）。在属水平上检测到389个菌属，其中110个菌属有显著差异（P<0.05）。与对照组相比，试验组奶牛瘤胃乳酸菌杆菌属丰度极显著增加（P<0.01），肠球菌属丰度极显著降低（P<0.01），克里斯滕森菌属显著降低（P<0.05），普雷沃菌属丰度显著增加（P<0.05），毛螺旋菌极显著降低（P<0.01），未注释毛螺旋菌属丰度显著增加，丁酸弧菌属-2（Butyrivibrio-2）丰度显著降低（P<0.05），瘤胃球菌属-1丰度显著提高。【结论】日粮添加玉米粉与油脂诱导奶牛乳脂降低，瘤胃细菌菌群多样性未产生显著影响，但菌群结构及丰度发生了较大改变，产酸菌属与淀粉利用菌属增加显著。

关键词：奶牛;乳脂降低;16S rDNA;高通量测序技术;瘤胃细菌

中图分类号：S 823文献标识码：A文章编号：1008-0384（2019）08-939-08

Abstract：【Objective】Changes on the fat content of milk from and rumen microbial flora in dairy cows fed with corn meal and flaxseed oil supplemented forage were studied. 【Method】 In a self-control experimentation， 4 Chinese Holstein cows of similar physical conditions and normal lactation were fed on a daily diet added with 1.5 kg of corn meal and 150 mL per animal of flaxseed oil for 7 pre-trial days followed by 15 days for the test. 【Result】In the feed containing approximately 27% starch， the dietary supplements significantly lowered the fat content （P<0.01） with a significantly higher lactose content （P<0.05） in the milk produced by the cows. There were 29 microbial phyla found in the rumen. The flora of Tenericutes significantly decreased （P<0.05）， Actinobacteria and Planctomycetes significantly increased （P<0.01）， and Spirochaetae significantly increased （P<0.05） over control. Among the 389 genera of microbes in the rumen， 110 were significantly different （P<0.05）. Comparing to control， Lactobacillus increased significantly （P<0.01）， Enterococcus decreased significantly （P<0.01）， Christensenellaceae R-7-group decreased significantly （P<0.05）， Prevotellaceae-UCG-001 increased significantly （P<0.05）， Lachnospiraceae-UCG-006 decreased significantly （P<0.01）， Lachnospiraceae-NA increased significantly， Butyrivibrio-2 decreased significantly （P<0.05）， and Ruminococcus-1 increased significantly. 【Conclusion】Under the experimental conditions， the dietary supplementation of corn meal and flaxseed oil significantly reduced the fat content in milk of the dairy cows. It did not significantly alter the diversity but significantly changed the structure and abundance of the microbial flora in the cow rumen. The acidogenic as well as starch-utilizing bacteria significantly increased.

Key words：dairy cow; milk fat reduction; 16S rDNA;high-throughput sequencing; rumen microbes

0 引言

【研究意义】乳脂降低综合征是指由营养因素引起的牛奶乳脂率降低的一种现象，降低幅度有时可达50%，但是乳蛋白、乳糖含量以及产奶量等并未受到显著影响[1]。乳脂降低综合征的奶牛日粮大多都有纤维素含量低、瘤胃易发酵碳水化合物含量高的特点[2]。利用高精高脂肪酸日粮连续饲喂奶牛，研究其对奶牛瘤胃中细菌菌群以及乳品质的影响，对进一步阐明乳脂下降机制、指导生产中日粮调控具有重要参考价值。【前人研究进展】王建平等[3]研究表明，饲喂高精料日粮虽然可以提高產奶量，但是乳脂率显著降低。国外研究发现，在日粮中添加大量快速发酵碳水化合物，或者添加植物油或鱼油均可诱导奶牛甚至奶山羊的乳脂明显降低，即诱导产生乳脂降低综合征[4-5]。高淀粉和高脂肪是有风险的添加剂，不仅会导致乳脂下降[6]，还会对瘤胃菌群产生影响。Belanche等[7]对比了粗饲和高精饲喂的羔羊，结果发现粗饲羔羊瘤胃中有更多的产琥珀酸丝状杆菌，瘤胃厌氧真菌和瘤胃细菌菌群的多样性也更高。国外研究表明[8]，随着日粮精粗比的增加，瘤胃纤维降解菌的生长会受到抑制。Huws等[9]在反刍动物饲料中添加鱼油，通过QPCR技术，发现瘤胃解脂厌氧弧菌、丁酸弧菌属、产琥珀酸丝状杆菌等的DNA发生改变，表明鱼油改变了反刍动物瘤胃的生物氢化。Neto等[10]对比了在放牧水平下，是否添加全大豆添加剂（油源）条件对阉牛的影响，结果表明添加油脂抑制了瘤胃纤维溶解菌的数量。Wanapat等[11]研究表明，随着日粮植物油的添加，水牛瘤胃微生物种群随之降低。研究表明，乳脂降低综合征与瘤胃中微生物群落的大规模转变之间存在关联[12]。【本研究切入点】研究发现在诱导奶牛乳脂降低综合征期间，奶牛瘤胃淀粉菌Prevotella bryantii、产琥珀酸丝状杆菌、溶纤维丁酸弧菌会减少，表明瘤胃微生物种群变化与乳脂降低综合征之间存在很强的相关性[13]。虽然前人了解奶牛乳脂降低与瘤胃微生物有关，但鲜少对比奶牛乳脂降低前后瘤胃菌群的变化。【拟解决的关键问题】本试验利用16S高通量测序技术分析玉米粉与油脂混合诱导奶牛乳脂下降情况下，奶牛瘤胃细菌菌群结构的变化，为探明二者的作用机制提供理论参考。

1 试验材料与方法

1.1 试验动物

试验动物由宁夏回族自治区某牧场提供。试验用玉米粉由宁夏某牧场提供，胡麻油为内蒙古赛星食品有限公司生产。

1.2 试验动物预处理

本试验采用自身对照试验设计，参考朱河水等[14]的试验方法。试验动物为泌乳期荷斯坦奶牛。在同一个圈舍，根据体况良好、体重相近、胎次相同、产奶量接近的原则，选取4头泌乳期中国荷斯坦奶牛。试验开始以基础日粮进行预饲，预饲期为7 d，以减少奶牛应激。预饲期后3 d开始采集瘤胃液并混合均匀，作为对照组（CK）。根据 NRC （2001） 奶牛饲养标准配制基础日粮，基础干物质日粮组成和营养成分见表1。采用TMR饲喂方式，全天自由饮水。试验预饲喂期为7 d。

1.3 淀粉与油脂添加方式

玉米粉和油脂奶牛组（CO）日粮中额外添加玉米粉（200目），含量为1.5 kg·头-1·d-1，参考Weimer等[12]，使饲料淀粉营养水平达到27%左右;额外添加胡麻油150 mL·头-1·d-1。玉米粉每日添加两次，每次添加750 g;油脂每日添加两次，每次添加75 mL，油脂和玉米粉均以灌服方式一同添加，保证奶牛每日添加的油脂和玉米粉完全采食，试验为期15 d。

1.4 试验样品的采集和处理

1.4.1 瘤胃液的采集方式

使用负压吸取装置（自行设计），通过奶牛口腔釆集瘤胃液。采集时间分别为饲喂前（0 h）及饲喂后2、4，6 h取样，每次取瘤胃液50 mL。分别在预饲期和试验期的后3 d采集瘤胃液，采集后立即放入冻存管放液氮临时保存，并转移到试验室放-80℃冰箱保存。为获得具有代表性的样品，化冻后将每天4个时间点所取的瘤胃内容物样品各取5 mL，充分混匀后备用。

1.4.2 牛奶的采集

试验牛每日清晨7∶30采奶，每次挤奶取两个奶样，每个牛奶样品采50 mL，分别在弃去头3把乳后，手工挤奶的方法采奶。奶样来自4个乳区，4个乳区的奶样混合后直接测定牛奶成分。

1.4.3 瘤胃液DNA的提取

取2 mL瘤胃液提取瘤胃微生物DNA，采用试剂盒法，试剂盒购于南京建成生物研究所。每头牛每个时间段瘤胃液取3管样品，即3个重复。

1.4.4 PCR扩增

PCR 扩增前用琼脂糖凝胶电泳检测 DNA 样品的纯度和浓度，于离心管中取适量的样品进行稀释。将稀释后的基因组 DNA 作为模板。瘤胃液DNA扩增目的片段为V3+V4区，引物序列为：V3+V4：341F-806R[15]。

341F：CCTACGGGNGGCWGCAG;

806R：GGACTACHVGGGTATCTAAT

1.4.5 PCR产物的混样与纯化

PCR产物使用2%的琼脂糖凝胶进行电泳检测;依照 PCR 产物浓度的检测结果进行等浓度混样，充分混匀后使用2%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，使用南京建成生物研究所提供的回收试剂盒回收产物。

1.4.6 Hiseq测序

将样品送至广州基迪奥生物科技有限公司进行Hiseq测序，其测序采用Hiseq2500 PE 250平台。

1.5 数据统计分析

数据采用Excel 2016进行初步处理，采用SAS 8.2统计软件中的随机区组设计进行数据处理。数据由平均值±标准误表示，P<0.05为差异显著，P<0.01为差异极显著。

2 结果与分析

2.1 奶牛乳品质变化

图1为日粮添加玉米粉和油脂后，牛奶乳脂变化曲线。表2为添加玉米粉和油脂对牛奶乳成分的影响。在添加玉米粉和油脂后，乳糖有显著提高（P<0.05），而乳脂率极显著降低;乳脂开始2 d有小幅度的上升，从第4 d开始迅速降低。约1周后，乳脂率开始稳定。可以发现乳脂稳定阶段与开始饲喂阶段，乳脂率降低超过48%，表明乳脂降低综合征诱导成功。

2.2 奶牛瘤胃细菌菌群序列及多样性分析

2.2.1 样品测序深度分析

本试验的瘤胃液样品的Shannon曲线见图2。当测序深度超过10 000 reads时，曲线趋于平缓，各样品达到饱和状态，表明本试验的测序深度足以覆盖各样品中大多数细菌。

2.2.2 瘤胃细菌菌群 OTUs 比较

经Illumina Hiseq测序结束后，除去低质量序列，通过序列拼接，应用Mothur根据97%的序列相似度，对序列进行OTU聚类，对样品进行OTU的统计，剔除稀有OTU后对照组CK样品获得2 900个，试验组CO样品获得2 779个。样品间差异不显著（P>0.05），两个样品共享OTU为2 344个。

2.2.3 瘤胃细菌alpha多样性分析

基于OTU的结果，计算了Alpha多样性。由表3可知饲喂玉米粉与胡麻油对奶牛瘤胃细菌菌群的Chao1值和Ace值与对照组比较，均有所减少，微生物数量有所减少，但差异不显著（P>0.05），说明饲喂乳脂下降后瘤胃细菌多样性无显著影响。与对照组比较瘤胃细菌菌群，试验组Shannon指数比对照组低，Simpson指数比对照组高，说明奶牛瘤胃菌群种类分布均匀度有降低，但是差异并不显著（P>0.05）。与对照组比较瘤胃细菌菌群的Shannon指数和Simpson指数均差异不显著。本试验覆盖率均大于99%，说明样品的采集足以反映瘤胃细菌菌群情况。

2.2.4 玉米粉与油脂处理奶牛瘤胃细菌在门水平上的变化

表4为在玉米粉和油脂诱导乳脂降低后部分细菌在门水平上的菌群变化。本试验共涉及29个门，包括芽单胞菌门Gemmatimonadetes、软壁菌门Tenericutes、装甲菌门Armatimonadetes、厚壁菌门Firmicutes、广古菌门Euryarchaeota、拟杆菌门Bacteroidetes、变形杆菌门Proteobacteria，迷踪菌门Elusimicrobia，浮霉菌门Planctomycetes，未注释菌门Bacteria-NA等。奶牛瘤胃厚壁菌门、拟杆菌门、变形杆菌门占总菌群比例的90%。与对照組相比，玉米粉和油脂诱导乳脂降低后奶牛瘤胃导软壁菌门丰度显著降低（P<0.05），放线菌门、浮霉菌门丰度极显著增加（P<0.01）;螺旋菌门丰度显著增加（P<0.05）。

2.2.5 玉米粉与油脂处理奶牛瘤胃细菌属水平上的变化

进一步细化分类到属，本试验奶牛瘤胃液菌群共涉及389个属种，其中110个菌属差异显著（P<0.05）。表5只列出了占总菌群0.1%以上且差异显著的菌属。分析结果可知，10个菌属丰度较高，包括链球菌属Streptococcus、克里斯滕森菌属Christensenellaceae、肠球菌属Enterococcus、魏斯氏菌属Weissella、乳酸杆菌属Lactobacillus、普雷沃氏菌属-1Prevotella-1、瘤胃球菌属Ruminococcus等。由表5可以看出，与对照组相比，试验组奶牛瘤胃乳酸菌杆菌属丰度极显著增加（P<0.01）;肠球菌属丰度极显著降低（P<0.01），克里斯滕森菌属显著降低（P<0.05），其他优势菌属变化不显著。除优势菌属外，其他菌属如普雷沃菌属丰度显著增加（P<0.05）;毛螺旋菌属丰度极显著降低（P<0.01），未注释毛螺旋菌属丰度显著增加;丁酸弧菌属-2Butyrivibrio-2丰度显著降低（P<0.05）;瘤胃球菌属-1丰度显著提高。

3 讨 论

3.1 玉米粉与油脂添加对奶牛乳脂含量的影响

试验结果表明，在饲料淀粉营养水平达27%左右的水平上额外添加胡麻油150 mL·头-1·d-1，连续添加15 d可以极显著降低奶牛的乳脂率，显著提高乳糖率。乳糖含量与饲料中淀粉和糖的含量有关[16]。刘峰等[17]研究表明，随着精料比例的增加，乳糖含量呈上升趋势，而乳脂率呈下降趋势，饲料的精粗饲料比对产奶量有显著影响。Rico等[18]对奶牛使用低纤维高脂肪日粮，结果成功诱导出乳脂下降综合症。国外研究表明，在日粮中添加植物油与鱼油混合，乳脂率会出现下降情况[19]。这都与本试验研究结果相似。研究表明当对奶牛添加含有大量精料或不饱和脂肪酸日粮后，瘤胃液和牛奶中的反-10-十八碳脂肪酸（trans-10 C18）含量增加[20]。Gaynor等[21]通过高精日粮诱导奶牛乳脂下降，证实了乳脂中的反式脂肪酸的增加与乳脂下降综合症存在联系。本试验中高精高脂肪酸的日粮条件可能是乳脂率降低的原因。

3.2 玉米粉与油脂添加对瘤胃菌群的影响

饲料中的不饱和脂肪酸对瘤胃的发酵有着明显的抑制作用，能够显著降低反刍动物对纤维素的消化率[22]。由表3可知，本试验导致瘤胃菌群种类分布均匀度有降低，瘤胃菌群种类与丰度减少。研究表明油脂会抑制瘤胃细菌的生长，甚至对瘤胃微生物的生长有毒性[23]。瘤胃内细菌有大部分黏附在饲料颗粒，饲料中添加油脂会使饲料颗粒表面润滑，使细菌难以附着也是瘤胃细菌菌群减少的原因之一[24]。还有研究认为脂肪酸可以吸附在细菌的细胞壁上，影响了营养物质通过，阻碍了细菌的生长[25]。

本试验表明，添加油脂并不一定能使瘤胃脂肪分解菌丰度提高。李旦[26]研究表明，日粮中添加豆油或者胡麻油会使瘤胃解脂厌氧弧菌丰度大幅度减少。研究表明，解脂厌氧弧菌的胞外脂肪酶最适pH为7.4[27]，在本试验中产酸菌增多的情况下，脂肪在瘤胃也不能正常消化。丁酸弧菌属是纤维降解菌，其丰度显著降低，说明其生长得到抑制，这与李旦等[28]研究结果一致。

乳脂降低与瘤胃中微生物群落的大规模转变之间存在关联。乳酸产生菌与乳酸利用菌之间的菌群平衡紊乱，瘤胃内乳酸积累，使瘤胃酸度降低＼[29-30＼]。研究表明，韦荣球菌属为乳酸利用菌＼[31＼]，本试验韦荣球菌属丰度极显著降低（P<0.01），而乳酸杆菌丰度极显著增加（P<0.01），表明瘤胃菌群平衡已经紊乱。试验表明，油脂虽然不是瘤胃酸中毒的原因，但是在日粮中随着与高淀粉日粮一起添加会增加瘤胃酸中毒的风险。由于本试验瘤胃丰度变化的菌群数量很多，部分在瘤胃占菌群总比例较少的菌群没有一一进行分析，但玉米粉和胡麻油诱导奶牛乳脂下降后，瘤胃的菌群的丰度和平衡已经发生了很大变化，细菌之间的协同作用以及数据还有待进一步整理和发掘。

3.3 玉米粉与油脂添加对瘤胃生物氢化的影响

反刍动物的乳脂及肌肉脂肪中的顺-9-反-11-共轭亚油酸（CLA）的来源之一就是在瘤胃细菌的作用下，亚油酸（C18∶2）被异构化为CLA[32]。因此，反刍动物食品中的共轭亚油酸与日粮中不饱和脂肪酸在瘤胃中的氢化程度密切相关。瘤胃的生物氢化作用开始于微生物对酰基甘油的脂解，然后再释放出游离脂肪酸以及甘油。游离的脂肪酸吸附在饲料颗粒之上，另外有部分脂肪酸被吸附在固相食糜上的细菌所吸收[33]。研究表明，丁酸弧菌属[34]、韦荣球菌属[35]等都与瘤胃的生物氢化有关，在本试验中这些菌属丰度都显著降低（P<0.05）。玉米粉与油脂诱导抑制了大量氢化菌的丰度，这与杨舒黎等[36]研究一致。

生物氫化涉及的细菌种类极其复杂，不同细菌之间的协同作用，同一微生物不同属间的相互作用非常复杂，很难具体说明每种菌在瘤胃中的作用，而且目前鉴定出参与瘤胃生物氢化的细菌还不多[37-38]，本试验的结果还有待进一步验证。就本试验结果来看，玉米粉与油脂组合抑制了瘤胃细菌的生长，降低了部分生物氢化菌的丰度。

4 结 论

在基本日粮基础上，添加玉米粉1.5 kg·头-1·d-1与油脂150 mL·头-1·d-1，连续添加15 d可以极显著降低奶牛的乳脂率，成功诱导奶牛乳脂降低。本试验条件下，日粮添加玉米粉与油脂对奶牛瘤胃细菌菌群多样性未产生显著影响，但菌群结构及丰度发生了较大改变，产酸菌属与淀粉利用菌属增加显著，部分瘤胃氢化菌属显著降低，瘤胃纤维降解菌属的影响结果不一，需要进一步研究。

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（责任编辑：张 梅）