铁线莲‘风之森林’叶绿素提取方法的比较研究

盛璐　孙梦娇　张茜茹　余开船　杨茜茜　洪立强

摘要：研究不同的提取溶剂和提取方法对‘风之森林’叶绿素含量的影响.以铁线莲‘风之森林’为试验材料，使用80%丙酮溶液、95%乙醇溶液、丙酮与无水乙醇（1：1）和丙酮：无水乙醇：水（4.5：4.5：1）这四种提取溶液，采用浸提法和研磨法分别处理，以期得出对于‘风之森林’来说叶绿素提取效果最佳的提取方法和提取剂.结果表明：当使用相同提取剂的不同提取方法时，浸提法提取效果最好;同种提取方法不同提取剂时，提取叶绿素效果最好的是丙酮与无水乙醇（1：1），其次丙酮：无水乙醇：水（4.5：4.5：1），再次95%乙醇溶液，最后为80%丙酮溶液.综合比较分析‘风之森林’叶绿素以丙酮与无水乙醇（1：1）为提取剂，浸提法处理效果最佳.

关键词：铁线莲‘风之森林’;叶绿素;提取溶剂

中图分类号：S68;Q244;TS202.3  文献标识码：A  文章编号：1673-260X（2019）09-0040-04

铁线莲（Clematis L.）是毛茛科、铁线莲属植物的总称，多年生栽培植物，花色丰富，供园林观赏的优良品种.大多数该属植物具有较高的药用价值，是具有多重胁迫抗性的重要药用植物[1].当前全国领域内，铁线莲有多种分类方式，铁线莲苗圃相对常用的一种归类法即“类群”归类法.包括早花大花型、晚花大花型、长瓣型、大叶型、卷须型等[2].其中早花大花型为大花铁线莲中的早花品种，多在春夏季老枝上开花.常见品种：吉赛尔（Giselle）、爱莎（Asao）、蜜蜂之恋（Bees Jubilee）、鲁佩尔博士（Doctor Ruppel）等[3].本实验研究早花大花型中的风之森林（Sen-No-Kaze）品种，日本品种，育种家Tetsuya Hirota于2004年推出.当年生枝上开花，具有开花永远重瓣、抗性强、花量大等特点，该品种喜充足阳光，适合花园种植，阳台或露台盆栽搭配深色背景看起来会更引人注目.当前我国对铁线莲属植被的研究主要集中在品种资源调查、品种分类研究和栽培繁殖等方向[4]，并探讨了铁线莲的园林应用方式和观赏特性.关于国内铁线莲优良品种的光合作用、呼吸作用、矿质营养、抗逆性等生理生态和国外优秀品种方面的研究尚不充分，如对铁线莲日本品种‘风之森林’的研究方面几乎是空白.在育种方面，‘风之森林’与国内品种进行杂交育种很有可能培育出不同花色、不同花型或不同开花季节的新品种.而目前对其研究包括发育与代谢机理等几乎空白.

叶绿素是高等植物和其他所有能进行光合作用的生物体含有的主要色素，直接参与光能的传输、分布和转换等过程.其含量不仅体现植物的光合作用能力、发育变化过程、生长情况、生理代谢程度及营养要求，还可作为环境生理研究的重要参照标准[5].不同的叶绿素提取方法以及不同的提取溶剂具有明显不同的提取效果.目前国内外对叶绿素的化学性质、提取分离方法、稳定性影响因子及其他生理功能等方面展开了一定的研究.其中对叶绿素含量提取与测定一直是研究的重点[6].由当前的研究进展可知，叶绿素提取方法应用较为普遍的有研磨静置法、单一溶剂和混合溶剂浸提法、冷冻浸提法等[7].提取溶液主要包括无水乙醇、纯丙酮以及不同比例有机溶剂形成的混合溶液，且认为无水乙醇和丙酮混合溶剂是用于提取叶绿素的优选提取剂.关于测定叶绿素含量的方法，主要使用紫外分光光度计、荧光分析、叶绿体仪等方法.已完成的相关实验有大叶黄杨、油茶、棉花、玉米和一些果蔬的叶绿素含量测定，且都根据实验得出了提取叶绿素较佳的方法和提取溶液.而关于‘风之森林’叶绿素提取与测定的研究未见报道，从而哪种提取方法更好更没有相应的参考依据.本次试验则通过采用四种提取溶剂和两种提取方法对‘风之森林’叶绿素含量测定进行研究，旨在找出最佳的提取方法，为‘风之森林’叶绿素含量提取方法的选择提供依据，准确地测定叶绿素含量以期为其生长发育以及逆境胁迫等实验提供基础.

1 材料与方法

1.1 材料與试剂

铁线莲‘风之森林’叶片、无水乙醇、纯丙酮、碳酸钙.

1.2 仪器与设备

752型紫外分光光度计、石英比色皿、万分之一电子分析天平、剪刀、研钵、容量瓶、试管.

1.3 试验处理

先按照体积比配置一定量提取溶液待用，即80%丙酮溶液、95%乙醇溶液、丙酮与无水乙醇（1：1）和丙酮：无水乙醇：水（4.5：4.5：1）.丙酮处理时需注意实验室通风，戴口罩，不使用时保持紧密并避免受损.

1.4 试验方法

1.4.1 研磨法

以提取溶液80%丙酮为例，在铁线莲‘风之森林’植株上选择生长发育情况良好、无病虫害的叶片，洗净，滤纸吸干，剪去大叶脉，其余叶片剪碎.使用天平精准称取0.2g叶片放入研钵中，然后加入80%丙酮2-3ml及少量碳酸钙进行研磨，磨成匀浆后，将其滤到25ml容量瓶中，然后用相应提取液把研钵、滤纸和杂质清洗至白色，将洗涤液滤到容量瓶中，最后用80%丙酮定容到25ml，上下倒置充分混合均匀.将叶绿素提取液倒入石英比色皿中，以对应提取剂为比较组，在紫外分光光度计下测波长645nm和663nm下的吸光度，根据Arnon法把叶绿素a和叶绿素b的含量计算出来.

用95%乙醇溶液、丙酮与无水乙醇（1：1）和丙酮：无水乙醇：水（4.5：4.5：1）提取液作对比试验，每种提取液都要重复三次试验.

1.4.2 浸提法

以提取液80%丙酮为例，叶片前期处理如研磨法，精准称取0.2g叶片，快速放于10ml试管中，加入少量碳酸钙和10ml提取液，并置于培养箱中黑暗浸泡24h，注意不时摇晃.24h后，取出待测铁线莲，将试管中绿色液体倒入25ml容量瓶中，最后用80%丙酮定容到25ml，充分混合均匀.后续处理与研磨法相同，即使用比色皿在分光光度计上测量相应波长下的吸光度值，使用公式计算叶绿素a和叶绿素b的含量.

1.5 数据处理

叶绿素含量的计算：

C=（12.71Α-2.59Α）V∕（1000m）  （1-1）

C=（22.88Α-4.67Α）V∕（1000m）  （1-2）

C=C+C    （1-3）

式中叶绿素含量的单位为mg/g，A和A分别为663nm和645nm下的吸光度值，V为提取溶剂体积即25ml，W为所取‘风之森林’叶片质量.

2 结果与分析

2.1 研磨法提取叶绿素

四种提取溶液对叶绿素提取效果的比较.试验结果见表1-1、表1-2、表1-3.从表中数据可以看出在室温条件下不同提取溶液对叶绿素提取效果不同.其中三次重复试验均表明研磨法提取效果最好的提取剂为丙酮与无水乙醇（1：1），叶绿素a的含量分别为1.333、1.220、1.253mg/g，叶绿素b的含量分别为0.545、0.455、0.472mg/g，总叶绿素含量分别为1.878、1.675、1.725mg/g.其次为丙酮：无水乙醇：水（4.5：4.5：1），再次是95%乙醇溶液，叶绿素提取含量最低的提取剂是80%丙酮溶液，叶绿素a的含量分别为0.818、0.914、0.861mg/g，叶绿素b的含量分别为0.260、0.324、0.320mg/g，总叶绿素含量分别为1.078、1.238、1.181mg/g.每种提取溶液的三次重复试验中，叶绿素含量有些许差别，可能与每次试验过程前叶片的选择和处理以及研磨过程中的研磨不完全有关，也可能与三次处理在空气中暴露时间不同有关.且三次试验处理时间不同，都有可能影响叶绿素含量.但四种提取剂的三次试验中，关于叶绿素研磨法提取效果由高到低的结果最终是相同的.

在前人研究的基础上，了解到碳酸钙具有减弱叶绿素分解的作用[8]，原因可能是在进行试验操作前，需把‘风之森林’叶片剪碎，而这会损害叶片结构，其细胞结构受到破坏会影响叶绿体中的色素，对色素所处环境产生一定的影响，这就导致叶绿素的结构发生改变，受到损害.碳酸钙能够保护微碱性的色素，减少叶绿素的损失，因此在两种方法中均加入了碳酸钙.

2.2 浸提法提取叶绿素

四种提取溶液对叶绿素提取效果的比较.使用浸提法不同提取溶液对‘风之森林’叶绿素提取的影响结果见表2-1、2-2和2-3.

由表可知，三次重复试验均表明浸提法提取效果最佳的提取溶液为丙酮与无水乙醇（1：1），由高到低依次为丙酮：无水乙醇：水（4.5：4.5：1）、95%乙醇溶液、80%丙酮溶液.结果也表明丙酮与无水乙醇（1：1）和丙酮：无水乙醇：水（4.5：4.5：1）这两种提取效果高于80%丙酮溶液和95%乙醇溶液.这也与其他相关叶绿素含量测定试验的结果相同，证实了浸提法提取叶绿素中混合溶液比单一溶液好，并了解到这可能是一种协同萃取作用，存在乙醇与丙酮之间，这种作用可以使叶绿素提取速度加快，从而高于单一溶液.在单一溶剂中，95%乙醇溶液提取效果又比80%丙酮溶液好，說明80%丙酮在提取叶绿素方面不充分，这是因为丙酮容易挥发，提取溶液少而影响叶绿素的提取.这与其他对柿树、玉米和菠菜等关于叶绿素含量的试验结果一致.而在查阅相关文献中，这一结果又与古川照雄用无水乙醇提取叶绿素的研究有一定的差别，他的研究则表明乙醇提取叶绿素不完全.张宪政也指出此种方法充分提取叶绿素所需时间长，对某些植物来说可能提取不够充分，精确度不高，所以这种方法的应用也不普遍[9].

2.3 两种提取方法的比较结果

首先从总体上看研磨法和浸提法关于提取叶绿素效果最佳的提取剂都为丙酮与无水乙醇（1：1），且提取剂提取叶绿素含量由高到低都依次为丙酮：无水乙醇：水（4.5：4.5：1）、95%乙醇溶液、80%丙酮溶液.

由上面六个表可知，浸提法提取叶绿素a的含量、叶绿素b的含量和总叶绿素含量都显著高于研磨法.使用研磨法，这四种提取剂所提取的叶绿素含量都显著低于浸提法，大概是因为在研磨过程中对‘风之森林’叶片研磨不彻底，研磨时间比较短，提取叶片叶绿素时间也相对短，叶绿素提取不完全且研磨时也会加快叶绿素的分解速度，这就会导致提取的叶绿素含量少.研磨时也可能会因为破坏了叶绿素的结构使提取后的叶绿素不稳定，见光时易分解[10].在对叶片研磨完成后的研钵、滤纸和杂质用提取剂清洗时，可能会因为未清洗干净而使叶绿素含量减少.浸提法操作简单方便，处理过程中叶片叶绿素相对提取完全，在黑暗中放置也会减少叶绿素的损失.这也与刘遵春等[11]的研究结果一致，都表现出提取叶绿素含量时浸提法优于研磨法.浸提法更适合于快速精确地提取‘风之森林’叶片叶绿素.

3 结论与讨论

试验结果表明，无论是使用研磨法还是浸提法，提取叶绿素效果最佳的选择都是丙酮与乙醇（1：1）.然后比较两种方法，研磨法步骤较多，工作量大，效率低速度慢，研磨过程会造成叶绿素的大量损失.而浸提法操作简单，效率高速度快，浸提过程中叶绿素损失少，提取相对完全，对于进行大批量叶片叶绿素含量测定具有重要实际意义.且由上述试验数据可知浸提法优于研磨法.因此，利用浸提法，采用丙酮与无水乙醇（1：1）提取液提取‘风之森林’叶片叶绿素为最佳方法.

关于叶绿素提取方法一直是研究的重点，不同研究植物所采用测定叶绿素含量的方法不同，同一研究植物叶片不同阶段、不同位置叶绿素含量也有所差别.而本次试验中采取‘风之森林’植物叶片，通过各种提取溶液提取，进行一系列操作来测定叶绿素含量，可能会有一定的误差[6].本次试验测定叶绿素采用了紫外分光光度计，但并不仅局限于这一种方法，目前还经常使用的是叶绿体仪.它小巧方便携带，可随时快速测定叶绿素含量，所测叶片受损程度小.王元军在对黑豆芽苗菜叶绿素提取方法进行研究时，还采用了冷冻浸提法，且他的研究结果已表明冷冻浸提法比浸提法和研磨法的效果好.这是因为冷冻过程会使细胞破碎，提取叶绿素过程速度比较快，减少了叶绿素损失，提取完全[12].程贵文等[13]对油茶叶绿素含量测定方法进行比较研究时，提取溶液中还加入了丙酮与无水乙醇（2：1），且得到的试验结果表明丙酮与无水乙醇（2：1）是最佳的提取方法.徐芬芬等[14]不仅探讨了不同提取方法下小白菜叶片叶绿素含量的提取效果比较，对其叶绿素在不同有机溶剂中的稳定性也展开研究.刘秀丽等人[15]还对影响叶绿素含量测定的因素如温度、光照等进行了一系列分析.可见对于‘风之森林’叶片叶绿素提取方法还有待进一步研究.

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参考文献：

〔1〕程贵文，龚洪恩，颜送宝，等.油茶叶绿素提取方法的比较研究[J].湖北林业科技，2017（6）：11-13.

〔2〕冯一峰，王艳，唐都，等.红枣叶片叶绿素提取方法的比较[J].中国酿造，2014，33（6）：50-53.

〔3〕黄持都，胡小松，廖小军，等.叶绿素研究进展[J].中国食品添加剂，2007（3）：114-118.

〔4〕刘遵春，冯爱英，扈惠灵，2014.柿树叶片叶绿素含量测定方法比较研究[J].河南科技学院学报（自然科学版），2014（4）：12-15.

〔5〕刘秀丽，宋平.植物叶绿素测定方法的再探讨[J].江苏农业研究，1999，20（3）：46-47.

〔6〕Roijackers RMM， 1981. A comparison between two methods of extracting chlorophyll-a from different phytoplankton samples[J].Hydrobiological Bulletin，15（3）：179-183.

〔7〕Wang WT， 2005. A new system of classification of the genus Clematis （Ranunculaceae）[J].Acta Phytotaxonomica Sinica， 43（5）：431-488.

〔8〕王元軍.黑豆芽苗菜叶绿素的提取方法[J].食品研究与开发，2010，31（2）：27-29.

〔9〕徐芬芬，叶利民，徐卫红，等.小白菜叶绿素含量的测定方法比较[J].北方园艺，2010（23）：32-34.

〔10〕袁军.铁线莲属植物遗传育种现状及其对策[J].农技服务，2009，26（11）：95-96.

〔11〕章银柯，江燕.我国铁线莲属植物研究现状及其园林应用[J].北方园艺，2007（3）：122-124.

〔12〕张燕，黎斌，李思锋.铁线莲属植物分类学及园艺学研究进展[J].中国野生植物资源，2010，29（5）：6-10.

〔13〕张秀君，孙钱钱，乔双，等.菠菜叶绿素提取方法的比较研究[J].作物杂志，2011（3）：57-60.

〔14〕张宪政.植物叶绿素含量测定方法比较研究[J].沈阳农业大学学报，1985（4）：84-87.

〔15〕张伏，张亚坤，毛鹏军，等.植物叶绿素测量方法研究现状及发展[J].农机化研究，2014（4）：238-241.