三角褐指藻△5脂肪酸延长酶基因克隆、过表达载体构建及生物信息学分析

雷娜娜 叶浩盈 赵靖悦 龚林 胡荣飞 何文锦 陈由强 薛婷

摘 要：通过RT-PCR的方法克隆三角褐指藻的△5-脂肪酸延长酶基因的cDNA序列，利用双酶切技术构建重组表达载体，并对该基因进行相关的生物信息学分析。结果表明：三角褐指藻△5-脂肪酸延长酶基因的cDNA全长为834 bp，编码278个氨基酸，预测的等电点为9.13，理论分子量32348.91。△5-脂肪酸延长酶基因中存在1个内含子，该酶属于ELO系列延长酶，可能定位于内质网中，包含多个跨膜区域和保守区域。亲缘关系分析表明，三角褐指藻△5-脂肪酸延长酶与假微型海链藻的亲缘关系最近。试验还成功构建了三角褐指藻△5-脂肪酸延长酶基因过表达重组质粒pPha-T1-5e，为下一步三角褐指藻中相关油脂代谢基因的表达和功能验证奠定基础。

关键词：三角褐指藻;△5-脂肪酸延长酶;克隆;生物信息学分析;载体构建

中图分类号：Q 943.2 文献标志码：A 文章编号：0253-2301（2019）09-001

Abstract： Through the method of RTPCR， cDNA sequence of △5-fatty acid elongase gene of Phaeodactylum tricornutum Bohlin was cloned， and the double enzyme digestion technique was used to construct the recombinant expression vector， and then the related bioinformatics analysis of the gene was carried out. The results showed that the fulllength of cDNA of △5-fatty acid elongase gene in Phaeodactylum tricornutum Bohlin was 834 bp， 278 amino acids were encoded， the predicted isoelectric point was 9.13， and the theoretical molecular weight was 32348.91. There was an intron existed in △5-fatty acid elongase gene， and the enzyme belonged to ELO series elongase， which could be located in the endoplasmic reticulum and contained multiple transmembrance domains and conserved domains. The genetic relationship analysis showed that △5-fatty acid elongase of Phaeodactylum tricornutum Bohlin had the closest relationship with Thalassiosira pseudonana Hasle et Heimdal. The overexpression recombinant plasmid pPhaT15e of △5-fatty acid elongase gene in Phaeodactylum tricornutum Bohlin was also successfully constructed in the experiment， which laid a foundation for the expression and functional verification of related lipid metabolism genes in Phaeodactylum tricornutum Bohlin.

Key words： Phaeodactylum tricornutum Bohlin; △5-fatty acid elongase; Cloning; Bioinformatics analysis; Vector construction

多不飽和脂肪酸（Polyunsaturated Fatty Acids，PUFAs）是指含有两个或多个双键且碳链长度为18个或更长的碳原子的脂肪酸[1]。PUFAs是真核生物中与细胞膜的流动性和选择透过性有关的重要组成成分[2]。特别是二十碳五烯酸（Eicosatetraenoic acid，EPA）和二十二碳六烯酸（Docosahexaenoic acid，DHA），即ω-3脂肪酸，对人体健康有好处[3]。这些脂肪酸与早期婴儿期和其他各种生理过程有关[4-5]。对预防动脉硬化、心脑血管疾病、神经退行性老年疾病和认知功能障碍方面具有重要意义[6-7]。此外，它们还具有促进脑部发育，改善视力，调节中枢神经系统，抗炎、抑制过敏反应的作用[8-9]，在治疗癌症方面也具有潜在的应用价值[10-11]。

目前，多不饱和脂肪酸主要是通过深海鱼油获得[12]。一方面，人们对PUFAs的需求不断增加，另一方面，由于过度捕捞和环境污染，海洋渔业日益衰退，并且鱼油具有胆固醇含量高和难闻的腥臭味等缺点，使PUFAs的生产和应用受到了限制[13]。所以必须开发可持续和可替代的PUFAs来源。海洋微藻作为自然界少数具有合成多不饱和脂肪酸能力的生物之一，具有分布广泛，种类多样，生长速度较快、适应能力强、单位面积产量高等优点[14]。因此，利用基因工程的方法在海洋微藻中生产多不饱和脂肪酸已经成为当前研究的热点[15]。

三角褐指藻是海洋硅藻研究的模式物种，属于硅藻门，羽纹纲，褐指藻目，褐指藻科，褐指藻属。三角褐指藻富含ω-3PUFAs，特别是EPA含量很高，占总脂肪酸含量的30%以上[16]。此外，三角褐指藻具有测序完整的基因组序列[17]，且易于遗传转化[18]，有望成为工业化生产EPA的原材料[19]。微藻中ω-3PUFAs的合成代谢是以α-亚麻酸（ALA）为底物，在各种脱氢酶和延长酶的催化作用下，经过一系列脂肪酸脱氢和脂肪酸延长作用转化成PUFAs，如二十碳五烯酸（EPA）、二十二碳六烯酸（DHA）和花生四烯酸（ARA）等[20]。其中EPA是在△5-脂肪酸延长酶催化作用下先转化为二十二碳五烯酸（DPA），再由△4-脂肪酸脱氢酶合成DHA[21]。因此，对于△5-脂肪酸延长酶的研究具有重要的意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 试验材料 三角褐指藻Phaeodactylum tricornutum购于中国科学院藻种库，现保存于本实验室。

1.1.2 菌株、酶及试剂 Escherichia coli DH5α为本实验室保存;克隆载体PMD-19T、T4 DNA连接酶、Dreamgreen酶、DNA Marker购于Takara公司;表达载体pPha-T1购于Addgene公司;限制性内切酶EcoR I、Xba I购于NEB公司;TransTaq DNA Polymerase High Fidelity聚合酶、TRNzoI RNA提取试剂盒、TransScript One-Step gDNA Removaland cDNA Synthesis SuperMix反转录试剂盒购于北京全式金生物技术有限公司;质粒DNA提取试剂盒、DNA纯化回收试剂盒购于天根生化科技（北京）有限公司;其他常规试剂均为国产分析纯。

1.1.3 培养基 LB营养琼脂、LB肉汤培养基购于生工生物工程（上海）有限公司。采用f/2培养基培养三角褐指藻[22]。

1.2 仪器与设备

Thermal Cycler PCR仪（美国Applied Biosystems公司）;高速冷冻离心机（美国Thermo公司）;超净工作台（苏州净化设备有限公司）;生化培养箱（国华电器有限公司）;电泳设备（Cell美国伯乐生物仪器公司）;凝胶成像仪（美国Bio-Rad公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 引物设计 引物设计采用Primer5.0软件设计。根据GenBank数据库中三角褐指藻的△5-脂肪酸延长酶基因片段（XM_002176650.1）设计引物，在引物中分别引入限制性内切酶EcoR I、Xba I（下划线部分），并送生工生物工程（上海）有限公司合成。

1.3.2 总DNA及总RNA的提取 将三角褐指藻接种到装有300 mL f/2液体培养基的三角瓶中，光照强度为3000 lx，光暗周期比为12 h∶12 h，温度20℃，每天摇动1～2次[23]。5000 r·min-1离心收集藻液，总DNA提取采用CTAB法[24]，总RNA提取按照TRNzoI RNA提取试剂盒的说明书提取。根据反转录试剂盒的要求，使用总RNA为模板，合成cDNA的第一链，并储存于-20℃备用。

1.3.3 △5-脂肪酸延长酶基因的克隆 以基因组DNA和cDNA为模板，采用高保真HiFi DNA聚合酶，以F和R为引物进行PCR扩增。PCR反应条件：94℃预变性5 min，94℃变性30 s;60℃退火30 s;72℃延伸1 min，30个循环，最后72℃延伸10 min，4℃恒温。回收纯化PCR扩增产物，连接到克隆载体PMD-19T中，连接产物转化大肠杆菌DH5α，在含有AMP的LB固体平板上筛选阳性克隆。筛选到的阳性克隆通过菌液PCR验证并由生工生物工程（上海）有限公司测序验证。

1.3.4 重组表达质粒的构建 构建流程如图1所示。将PCR产物和表达载体pPha-T1分别用EcoR I、Xba I双酶切，胶回收试剂盒纯化回收之后用T4 DNA连接酶连接，并转化到大肠杆菌DH5α中，采用CaCl2法制备大肠杆菌DH5α的感受态细胞，采用42℃热激法进行转化。通过氨苄抗性筛选阳性克隆，并经过菌液PCR鉴定和酶切验证，提取重组质粒pPha-T1-5e，并送生工生物工程（上海）有限公司进行测序。

1.3.5 生物信息学分析以及系统进化树的构建 蛋白质的理化性质分析使用ExPASy-ProtParam在线程序分析（http：//web.expasy.org/cgibin/protparam/）。蛋白质的亲水性和疏水性利用ProtScale在线程序预测（http：//www.expasy.org/cgibin/protscale.p1）;蛋白质的保守结构域是利用NCBI的CDD在线程序分析（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）;蛋白質的跨膜结构域利用TMHMM-2.0在线程序预测（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/）;蛋白质的信号肽预测利用SignalP 4.1 Server在线程序完成（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignaLP/）;多序列比对利用Clustal X软件比对;二级结构由SOPMA预测（https：//npsaprabi.ibcp.fr/cgibin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html）;磷酸化位点利用NetPhos 3.1在线程序预测（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）。使用MEGA4.0软件对相似序列进行多序列比对，并使用邻接法（Neighbor Joining）构建系统进化树[25]。

2 结果与分析

2.1 三角褐指藻总RNA的提取及目的基因的克隆

电泳结果如图2A所示，出现3条带，从上往下依次是28S rRNA、18S rRNA和5S rRNA，前2个条带比较清晰，第3条带较模糊，说明完整性较好，没有发生明显的降解。RNA的浓度和纯度采用超微量紫外分光光度计检测，纯度结果A260/A280在1.8～2.0，所得到的RNA浓度为250 ng·μL-1，总体积为50 μL。说明RNA质量比较好，可以满足后续试验的要求。

获得的总RNA经反转录合成cDNA第一链，以cDNA和基因组DNA为模板，获得目的基因大小分别为834 bp和936 bp，质量体积分数为1.0%琼脂糖凝胶电泳结果如图2B所示。电泳结果表明，目的基因大小与预期大小一致。回收扩增片段连接克隆载体PMD-19T，转化大肠杆菌进行菌液PCR验证并送去测序，测序结果经过Blast在线比对表明，本试验扩增得到的△5-脂肪酸延长酶基因cDNA序列与三角褐指藻的cDNA序列一致。这些结果表明已扩增得到了三角褐指藻△5-脂肪酸延长酶基因。

2.2 重组过表达质粒的鉴定

将用EcoR I和Xba I双酶切的基因片段与表达载体pPha-T1连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，获得阳性克隆，摇菌提取质粒，如图3所示，双酶切发现，重组质粒切出约4.1 kb的片段和0.9 kb的目的片段，与预期结果一致，并将质粒送生工生物工程（上海）有限公司测序，显示结果正确，说明重组质粒pPha-T1-5e构建成功。

2.3 生物信息学分析

2.3.1 理化性质分析 通过BioEdit软件分析三角褐指藻△5-脂肪酸延长酶基因的核苷酸序列，其中G+C含量为48.20%，A+T含量为51.80%，是1个完整的开放阅读框。使用Protparam程序在线分析，该蛋白的等电点为9.13，蛋白质分子量为32348.91，分子式推测C1534H2249N373O372S15。不稳定指数为30.20，推测该蛋白为稳定蛋白。预测在酵母中表达的半衰期大于20 h，在大肠杆菌中表达的半衰期大于10 h，而在哺乳动物网状细胞中体外培养表达的半衰期为30 h。该蛋白由20种基本氨基酸组成，含量较高的氨基酸残基为亮氨酸（Leu，12.2%）和缬氨酸（Val，9.4%），含量较低的氨基酸残基为半胱氨酸（Cys，1.4%）和谷氨酸（Glu，1.8%）。其中有23个带正电荷的氨基酸（Arg+Lys），16个带负电荷的氨基酸（Asp+Glu）。通过protscale程序在线分析，氨基酸序列疏水性/亲水性预测结果显示如图4，亲水性平均系数为0.250，推测其为疏水性蛋白，其脂肪系数为92.88。

2.3.3 二级结构分析 通过在线软件SOPMA预测蛋白质的二级结构，结果如图7。△5-脂肪酸延长酶二级结构包括：α螺旋、延伸链、β转角、

无规则卷曲。其中占比最高的为α螺旋，约为43.17%;无规则卷曲约为29.14%;延伸链约为22.66%;而β转角所占比例最少，仅为5.04%。由此可知，α螺旋和无规则卷曲是△5-脂肪酸延长酶二级结构的主要组成，属于混合型蛋白。

2.2.4 蛋白多序列比对、保守结构域和磷酸化位点分析 NCBI保守结构域数据库分析表明，该蛋白属于ELO系列家族，如图8所示。为了进一步研究△5-脂肪酸延长酶中的保守结构域，对不同物种的△5-脂肪酸延长酶进行序列比对，结果如图9所示。发现氨基酸序列具有典型的△5-脂肪酸延长酶保守结构域FLHXXHH和MYSYY，而后者是微藻△5-脂肪酸延长酶的典型序列。

蛋白质磷酸化是真核生物最主要的蛋白质翻译后修饰方式，会影响蛋白质的功能和活性，因此磷酸化分析对研究蛋白质的功能具有重要意义。NetPhos3.1预测到△5-脂肪酸延长酶中有16个磷酸化位点，如图10所示，包含7个丝氨酸磷酸化位点、3个苏氨酸磷酸化位点、6个酪氨酸磷酸化位点。

2.3 系统进化分析

Blast分析发现三角褐指藻△5-脂肪酸延长酶与假微型海链藻（Thalassiosira pseudonana）相似性较高，为53%;与巴夫藻（Pavlova）和塔胞藻（Pyramimonas cordata）的△5-脂肪酸延長酶相似性分别为41%和37%。利用GenBank数据库上不同物种的△5-脂肪酸延长酶，使用N-J距离法构建了进化树，如图11所示。结果表明，三角褐指藻△5-脂肪酸延长酶与假微型海链藻中的△5-脂肪酸延长酶的遗传距离最近，这表明他们之间的亲缘关系最近。

3 讨论与结论

目前，随着越来越多的人认识到多不饱和脂肪酸的重要性，脂肪酸相关酶基因的研究也成为热点。微藻是多不饱和脂肪酸的主要合成者，已有多种微藻的脂肪酸去饱和酶或延长酶基因被克隆。△5-脂肪酸延长酶是一种多不饱和脂肪酸延长酶，是DHA合成过程中的关键酶。

本试验以三角褐指藻为研究对象，通过RT-PCR的方法克隆得到了△5-脂肪酸延长酶基因的cDNA序列，并通过各种信息学软件对其进行了理化性质分析、二级结构预测、序列比对、系统进化树、磷酸化位点等分析。分析结果表明，△5-脂肪酸延长酶基因的cDNA全长为834 bp，编码278个氨基酸，编码的蛋白为稳定的疏水性蛋白质。Blast比对和NCBI Spidey分析显示，该基因有1个内含子，位于DNA序列的468～571 bp处，将整个基因分成2个外显子。藻类中多不饱和脂肪酸的合成位于细胞质中，对△5-脂肪酸延长酶基因细胞定位的预测表明，位于内质网，它是一种膜结合蛋白，具有较多的跨膜结构域。本试验为微藻脂肪酸延长酶基因的结构和特性的研究提供了参考，为进一步研究三角褐指藻中△5-脂肪酸延长酶的基因表达和确定其功能提供了帮助。本试验还成功构建了三角褐指藻△5-脂肪酸延长酶基因过表达重组质粒pPha-T1-5e，为今后三角褐指藻中相关油脂代谢基因的功能验证及高含量油脂重组藻株的构建提供可借鉴的方法。

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（責任编辑：柯文辉）