LC-MS/MS法测定石斛碱在大鼠体内药代动力学研究

白俊其　黄娟　徐文　张靖　宫璐　黄志海　丘小惠

摘要 目的：建立LC-MS/MS分析方法测定大鼠血浆中石斛碱浓度，考察其体内药代动力学特征。方法：SD大鼠6只灌胃给予石斛碱（20 mg/kg），于给药前及给药后5、15、30、45、60、90.120、180、240、420、600、1 440 min眼内眦静脉从取血，测定大鼠血浆石斛碱浓度。用DAS2.0统计软件计算药动学参数。结果：石斛碱浓度在0.5～50 ng/mL范围内线性关系良好（r2=0.999 2），定量下限为0.5 ng/mL，低（1 ng/mL）、中（5 ng/mL）、高（20 ng/mL）3个浓度的回收率分别为（78.86±4.56）%、（85.25±1.23）%及（80.56±2.23）%;日内及日间RSD均小于10%。石斛碱给药后血药浓度-时间曲线符合二室模型，消除半衰期为t1/2为（51.27±2.65）min，Tmax为（10.00±0.17）min，Cmax为（0.12±0.08）mg/L，AUC（0-∞）为（7.91±0.25）mg/L·min。结论：本分析方法对石斛碱体内外检测具有专属性，且灵敏、可靠，适用于石斛碱药代动力学研究。

关键词 石斛碱;药代动力学;血药浓度;LC-MS/MS

Pharmacokinetics of Dendrobin in Rats by LC-MS/MS

Bai Junqi，Huang Juan，Xu Wen，Zhang Jing，Gong Lu，Huang Zhihai，Qiu Xiaohui

（The Second Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine， Guangdong Provincial Academy of Chinese Medical Sciences，China Academy of Chinese Medical Sciences Guangdong Branch，Guangzhou 510006，China）

Abstract Objective：To establish an LC-MS/MS method for determination of dendrobine， and to study the pharmacokinetics of dendrobine in rats.Methods：Six male rats were orally administered with Dendrobium（20 mg/kg），Plasma samples were collected at 5、15、30、45、60、90.120、180、240、420、600、1440 min after the drug administration.The pharmacokinetic parameters were calculated by DAS2.0 software.Results：The calibration curves were linear over the concentration ranging from 0.5 to 50 ng/mL（r2=0.9992）with the LLOQ of 0.5 ng/mL.The intraday and interday RSD were generally good（<10%）.The concentration-time curve for dendrobine was in accordance with the two-compartment model， The main pharmacokinetic parameters t1/2， Tmax， Cmax， AUC（0-∞）were as follows：（51.27±2.65）min，（10.00±0.17）min，（0.12±0.08）mg/L， （7.91±0.25）mg/L·min.Conclusion：The analytical method developed is sensitive specific rapid and reproducible and is proved to be suitable for the pharmacokinetic study of dendrobine.

Key Words Dendrobine;Pharmacokinetics;Blood Concentration;LC-MS/MS

中圖分类号：R284.2文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2019.09.010

金钗石斛是名贵中药，为兰科石斛属植物金钗石斛（Dendrobium.nobile Lindl）的新鲜或干燥茎，它作为中药石斛的基原植物之一被收入《中华人民共和国药典》[1]。有研究发现金钗石斛具有抗衰老、抗肿瘤及增强免疫功能等作用[2-3]。金钗石斛含有生物碱、倍半萜、联苄、菲类、多糖等多种类型的化学成分[4-7]。早在1932年铃木秀干等于金钗石斛中首次分离得到石斛碱[8]。1935年陈克恢再于金钗石斛中获得石斛碱[9]，石斛碱是一种倍半萜类生物碱[10]，是石斛总碱中含量最高的[11-12]，石斛碱具有止痛、解热、降低心率和血压、减慢呼吸、使血糖中度升高、解巴比妥毒及缓解白内障等作用[13-15]，具有较高的研究开发价值。关于石斛碱药效学研究已有很多报道，对于石斛碱药代动力学研究较少，仅有一篇石斛碱尾静脉注射后药代动力学研究[16]，目前尚无对石斛碱口服后其药代动力学研究的报道，本文建立LC-MS/MS法测定石斛碱在大鼠血浆血药浓度变化，研究口服石斛碱后其在大鼠体内药代动力学，为进一步开发金钗石斛相关产品提供依据，对于提高药物的疗效和安全性有重要意义。

1 材料

1.1 仪器

Thermo Scientific TSQ Quantum Ultra液相色谱质谱联用仪，Xcalibur样品分析系统，Lcquan 2.6定量处理软件，Elix5型纯水机（美国Millipore公司），XW-80A型涡旋混合器（上海医科大学仪器厂），Eppendorf高速冷冻离心机（德国Eppendorf公司），步琪R210型真空浓缩仪（瑞士步琪公司）。

1.2 实验药品与试剂

对照品石斛碱（批号：111876-201102）及内标氯雷他定（批号：100615-201404）均购于中国药品生物制品检定所，受试石斛碱（实验室自制，纯度>95%），乙腈、甲醇（色谱纯，merck公司），超纯水为自制（经Milli-Q纯水器净化）。

2 方法

2.1 LC-MS条件

2.1.1 色谱条件

色谱柱Agilent Poroshell120 SB-C18（2.1×100 mm，2.7 μm）;流速：200 μL/min，进样量5 μL;流动相：乙腈（C）-水（A），梯度洗脱（0～2 min，5%～30%;2～4 min，30%～60%;4～7 min，60%～95%）。

2.1.2 质谱条件

离子源：电喷雾离子源（ESI）;离子检测方式：SRM;离子极性：正离子;Capilary Temperayure：350 ℃;Vaporizer Temperature：250 ℃;Sheath Gas Pressure（Arb）：30;Aux Gas Pressuer（Arb）：15;Ion Sweep Gas Pressure（Arb）：0;positive Polarity：3000。用于定量的离子对264.15/105.08，176.17，218.20;碰撞能量分别为34，34，25;内标氯雷他定离子对383.00/267.00，碰撞能量28。

2.2 溶液配制

2.2.1 石斛碱标准溶液配制 精密称取石斛碱适量，加入适量甲醇溶解配制成100 ng/mL标准液，4 ℃冰箱储存备用。

2.2.1 石斛碱溶液配制 精密称取石斛碱样品20.00 mg，加入80 mL超纯水，配制成浓度为0.25 mg/mL溶液，4 ℃冰箱储存备用。

2.2.3 内标溶液配制 精密称取氯雷他定适量，加入适量甲醇溶液配制成1 mg/mL的内标液，精密量取上述内标液适量，加入适量甲醇溶液并稀释得到1 ng/mL内标液。

2.3 方法专属性

取空白甲醇溶液、空白血浆、空白血浆加石斛碱、内标氯雷他定、10 min血浆样品，分别经LC-MS检测后，记录色谱图，考察专属性。

2.4 线性关系考察

精密量取200 μL空白血浆，加入8 μL内标液，加入192 μL对照品溶液，加入400 μL甲醇，按2.7项下的方法操作后进样，配成石斛碱终浓度为50、20、10、5、2、1、0.5 ng/mL对照品溶液，进样5 μL经LC-MS测定，记录峰面积。

2.5 精密度和准确性实验

配制低、中、高3个浓度为1、5和20 μg/mL的石斛碱含药血浆并绘制相应随行曲线，每批每浓度各5份及1条随行曲线，2.7项下方法操作后进行分析，在1 d内分别测定5份样品，计算日内精密度;每天各测一份样品，连测5 d，计算日间精密度。

2.6 稳定性实验

取1、5和20 μg/mL的石斛碱含药血浆，分别置室温12 h、进样器内8 h，-70 ℃冰箱冻融3次，各条件同一浓度平行处理3份测定。

2.7 回收率实验

配制低、中、高3个浓度为1、5和20 μg/mL的石斛碱含药血浆溶液，每浓度5份，按5.5项下方法操作后进样分析，分别记录血浆样本及标准溶液的石斛碱色谱峰面积A1及A2，以A1/A2×100%计算回收率。

2.8 血浆样品处理

精密量取大鼠200 μL血浆，加入8 μL内标液，加入592 μL甲醇，振荡3 min，12 000 r/min离心10 min，取上清液，过0.22 μm滤膜，取上清液5 μL进样。

2.9 给药方法与血样采集

SD大鼠6只，于实验前晚禁食，期间可自由饮水。以0.3%羧甲基纤维素钠（CMC-Na）配成含石斛碱2.0 mg/mL混悬液，给药体积10 mL/kg。灌胃给药前，经大鼠眼眶静脉丛采集血样约0.5 mL，作为空白对照。并分别于灌胃给药后5、15、30、45、60、90.120、180、240、420、600、1 440 min采集血样0.5 mL。置1.5 mL抗凝离心管中，10 000 r/min离心10 min，取上清液，-80 ℃储存备用。

2.10 动力学参数计算

将各个测定数据列成不同时间血药浓度数据表，求出均值及标準差（±s）。将每个动物血药浓度（C）与时间（t）数据用药代动力学计算程序DAS2.0进行C-t曲线拟合，并计算出每个动物有关药代动力学参数。

3 结果

3.1 方法学评价

3.1.1 专属性

本实验色谱条件下，石斛碱出峰时间在4.39 min，内标氯雷他定出峰时间在6.12 min，峰形良好，血浆中内源性物质对两者的测定无干扰，基线平稳。见图1。

3.1.2 线性及灵敏度

以石斛碱的浓度C（ng/mL）为横坐标进行线性回归，权重系数1/C2，得标准曲线的回归：Y=0.123X+0.071，r2=0.999 2（n=6）线性范围为0.5～50 ng/mL，定量下限为0.05 ng/mL。

3.1.3 精密度实验

高、中、低浓度生物样品日内、日间峰面积与内标物峰面积之比RSD<10%，精密度良好。见表1。

3.1.4 稳定性实验

生物样品置室温12 h、进样器内8 h，-70 ℃冰箱冻融3次，测定对照品和内标物峰面积，各濃度样品测定值的RSD均小于10%，说明在个条件下稳定性良好。

3.1.5 加样回收率实验

高、中、低浓度生物样品回收率大于70%，满足生物样品分析检测要求。见表2。

3.2 药代动力学

6只大鼠按5.4项下给予石斛碱混悬液，测定不同时间点血浆药物浓度。见图2。以二室模型统计矩方法，计算药代动力学参数，主要动力学参数见表3。

4 讨论

石斛碱为金钗石斛指标性成分，在总生物碱中含量是最高的成分，药理活性较好，但对于分离纯化大多借助高效液相等仪器，本文采用酸水提取，石油醚萃取，然后经正相层析法及结晶法可从金钗石斛中得到较大量纯化石斛碱，整个过程操作简单，对石斛碱大生产提供思路。

本实验建立测定体内外石斛碱LC-MS/MS法，具有很高的专属性，每一样品的分析时间只需7 min。在所建立的色谱分离条件下，血浆中内源性杂质及代谢物不干扰样品测定。此法灵敏度高，方法的重现性好，操作简便、结果准确，仪器定量下限可以达到0.5 ng/mL，适合石斛碱体内外药物分析。本研究主要考察自制石斛碱灌胃给予在大鼠体内血药浓度-时间变化趋势，大鼠灌胃给予石斛碱后药代动力学为二室模型，t1/2α为2.24 min，Tmax为10 min，均表明石斛碱迅速自胃肠道吸收入血。t1/2β为51.27 min，远大于t1/2α，说明石斛碱在体内主要以消除过程为主，且消除过程较快，在体内不易引起蓄积。

参考文献

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（2017-05-09收稿 责任编辑：张雄杰）