HPLC法同时测定灌胃补肾通络方大鼠血浆中马钱苷、阿魏酸和二苯乙烯苷含量

黄攀　刘湘丹　马铭　卢岳华

摘 要 目的：建立灌胃补肾通络方大鼠血浆中马钱苷、阿魏酸和二苯乙烯苷的含量测定方法. 方法：以甲醇-乙酸乙酯（V甲醇∶V乙酸乙酯=3∶1）提取处理血浆，氮气吹干后流动相复溶进样.色谱条件： Johnson spherigel C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相： 甲醇-0.01%乙酸水溶液，梯度洗脱；检测波长： 马钱苷为235 nm，阿魏酸和二苯乙烯苷为320 nm；流速： 1 mL/min；柱温： 30 ℃；进样量： 10 μL. 结果：空白血浆中内源性物质不干扰样品的测定.马钱苷、阿魏酸和二苯乙烯苷分别在0.03～3.00，0.03～3.00和0.02～2.00 mg/L范围内均有良好的线性关系（r≥0.999） ，检测限依次为0.020，0.015和0.010 mg/L；提取回收率分别大于79%、74%和58%，日间、日内精密度（RSD）均分别小于10%，7.3%和9.7%.结论：所建立的含量测定方法操作简便，灵敏，准确，适用于大鼠灌胃补肾通络方后血浆中马钱苷、阿魏酸和二苯乙烯苷的同时测定，为补肾通络方中有效成分药动学研究提供参考.

关键词 补肾通络方；马钱苷；阿魏酸；二苯乙烯苷；血药浓度；高效液相色谱法

中图分类号 R284.1 文献标识码 A 文章编号 1000-2537（2015）03-0053-05

补肾通络方是临床常用有效治疗肾病综合征（Nephrotic syndrome， NS）的经验方，由制首乌、白术、当归、丹参、淮山、山茱萸、川芎、爵床、车前子、泽兰等药物组成，临床及实验研究表明其对NS肾虚夹瘀症有较好的治疗作用[1-3].为进一步阐明该方的作用机制，建立其主要活性成分的体内分析方法尤为重要.马钱苷是山茱萸的有效成分之一，具有增强机体免疫能力等生理活性[4-5].阿魏酸是当归和川芎的有效成分之一，具有抗氧化、抗血栓、降血脂、抗菌消炎、解毒保肝等作用[6-8].二苯乙烯苷是首乌的有效成分之一，具有抗氧化、调血脂的作用，可延缓或减轻动脉粥样硬化的发生和发展[9-10].本实验建立了灌胃补肾通络方大鼠体内血浆中马钱苷、阿魏酸和二苯乙烯苷的含量测定方法，为补肾通络方作用机制的进一步研究奠定分析基础.

1 仪器、试剂与材料

Agilent 1100型高效液相色谱仪（美国Agilent公司）；MX-S型涡旋仪（北京大龙兴创实验仪器有限公司）；TG-16G高速离心机（湖南凯达科学仪器有限公司）；MTN-2800D氮吹浓缩装置（天津恬静奥特赛恩斯仪器有限公司）；AUW220D分析天平（日本Shimadzu公司）；SZ-93自动双重纯水蒸馏器（上海雅荣生化仪器设备有限公司）.

马钱苷对照品（批号11640-201005，质量分数99.2%）、阿魏酸对照品（批号110773-201012，质量分数99.6%）、二苯乙烯苷（2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄苷）对照品（批号110844-201310，质量分数91%）均购自中国食品药品检定研究院，甲醇、乙酸乙酯为色谱纯，水为重蒸水，其余试剂均为分析纯.补肾通络方稠浸膏由湖南中医药大学第一附属医院制剂科制备（批号20130406），含生药10 g/mL.项目组前期研究测定补肾通络方稠浸膏中马钱苷、阿魏酸和二苯乙烯苷质量浓度分别为2.5147，0.2925，3.1190 g/L[11].

清洁级近交系雄性Sprague-Dawlay（SD）大鼠，购自湖南中医药大学实验动物中心，体重250±20 g，SPF级动物房标准饲料常规饲养，合格证号为SCXK（湘）2011-0003.

2 方法与结果

2.1 对照品溶液的制备

准确称取马钱苷、阿魏酸和二苯乙烯苷各10 mg，置10 mL容量瓶中，加甲醇溶解定容至刻度，摇匀，制成1.0 g/L的对照品储备液；精密量取适量，用甲醇稀释成系列混合对照品溶液，质量浓度分别为0.05，0.75，1.00，1.50，2.50，5.00，25，50，100和150 mg/L，置于4 ℃冰箱内备用.

2.2 血浆样品的制备及预处理

取雄性SD大鼠6只（250～280 g），隔夜禁食24 h，自由饮水.将补肾通络方稠浸膏按15 μL/g大鼠灌胃给药，分别于给药前及给药后30 min采血，置涂肝素钠的PCR管中，8 000 r/min，4 ℃下离心10 min，取上清血浆，分装标号，于-20 ℃保存备用.

用微量加样器取150 μL血浆，置于0.5 mL棕色高速离心管中，加入450 μL甲醇-乙酸乙酯（V甲醇∶V乙酸乙酯=3∶1）混合溶液，涡旋1 min，10 000 r/min高速离心10 min，提取两次合并上层有机相，然后加入1.0 mol/L的盐酸25 μL，常温下氮气挥干，残渣准确加入25 μL流动相（V甲醇∶V0.01%乙酸水溶液=30∶70）复溶，涡旋1 min，10 000 r/min 离心5 min，取上清液10 μL进样.

2.3 色谱条件及方法专属性考察

色谱条件：色谱柱：Johnson spherigel（大连江申）C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）； 流动相：甲醇-0.01%乙酸水溶液梯度洗脱（0～18 min，30%甲醇；18～25 min，30%～45%甲醇；25～30 min，45%～50%甲醇；30～35 min，50%～30%甲醇）； 流速：1.0 mL/min； 检测波长： 235 nm（0～18 min），320 nm（18～32 min），235 nm（32～35 min）；柱温：30 ℃； 进样量：10 μL.

专属性考察：精密取大鼠空白血浆、大鼠空白加标血浆（相当于马钱苷、阿魏酸及二苯乙烯苷质量浓度2.0 mg/L）和含药血浆各150 μL，按2.2项下血浆样品预处理操作，按2.3项下色谱条件测定.