三种澄清方式对‘美乐’甜型桃红葡萄酒品质的影响

牛见明，张波，史肖，李宁宁，李宏涛，韩舜愈*

1(甘肃农业大学 食品科学与工程学院，甘肃 兰州，730070)2(甘肃省葡萄与葡萄酒工程学重点实验室，甘肃省葡萄与葡萄酒产业技术研发中心，甘肃 兰州，730070)3(宁夏西夏王葡萄酒业有限公司，宁夏 银川，750104)

葡萄酒是以葡萄或葡萄汁为原料，经全部或部分酒精发酵酿制而成的含有一定酒度的酒精性饮料。其中葡萄酒的外观作为消费者对其品质评价的重要参考，不仅赋予酒一定的质量特征，同时还与香气及口感指标一同决定着葡萄酒的整体和谐程度[1-2]。通常认为葡萄酒的外观主要由澄清度和颜色两方面构成。此外，外观还是判断葡萄酒生物稳定性的重要指标之一，成为葡萄酒生产中的关键控制环节[3-4]，特别对于甜型葡萄酒而言，澄清方式直接影响着葡萄酒的品质[5]。

目前，葡萄酒实际生产过程中澄清方式可分为3种：自然澄清、机械澄清和化学澄清[6]。自然澄清是指酒中的颗粒悬浮物在其重力的作用下自然下沉，从而使酒体澄清的过程，这也是近年来有机葡萄酒酿造潮中的一个研究热点。但经自然澄清处理的葡萄酒的澄清度及耗时是该工艺的主要缺陷[7]，因此酿酒师在自然澄清的基础上通过添加明胶、皂土、鱼胶、果胶酶、聚乙烯吡咯烷酮(polyvinyl pyrrolidone，PVPP)等澄清剂来提高澄清效果、缩短澄清时间[8-9]。不过这些方法常会因外源化学试剂的添加而导致葡萄酒产生安全性问题，例如鱼胶和酪蛋白等动物源的澄清剂可能会引起人畜共患病的传播[10]。同时，酪蛋白还可能会引起一些特殊人群的过敏反应，若使用过量不仅使酒体浑浊，甚至会产生胶味等不良气息[11]。

机械澄清在生产中是较为常用的措施之一，该过程主要是利用适当的过滤器、离心机等多孔膜设备进行固相物质和液相物质的分离，达到去除葡萄酒中悬浮物和微生物的效果。常用的处理方式包括低速冷冻离心、框式过滤和硅藻土过滤、错流过滤等[12]。特别是离心和错流过滤，有研究显示，其在工艺优化、提高酒体质量、安全环保等方面具有明显的优势[13]。EI-RAYESS等在比较错流过滤与其他澄清方式后发现，错流过滤自动化程度高，可极大地缩短葡萄酒澄清处理时间，提高生产效率，大量节省人力和物力消耗[14]。此外，相较于一般的过滤方式，离心和错流过滤还可对部分原酒的褐变进行控制[15]。但是，尽管目前关于错流过滤和离心澄清的研究已有报道，而综合比较两者在风味品质和除菌效果等方面的研究仍很有限。因此，本试验采用离心及错流过滤等澄清方式，通过研究其对美乐甜型桃红葡萄酒澄清效果、风味品质和生物稳定性的影响，以期为葡萄酒的酿造生产及工艺优化提供一定的数据支撑和技术参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

美乐甜型桃红葡萄酒:实验室自行酿造，所选葡萄为2017年甘肃省武威黄羊镇莫高酿酒葡萄基地美乐品种，含糖量约为 23.3 Brix°，含酸质量浓度 7.65 g/L(以酒石酸计)；酿酒酵母(红佳酿，Vintage Red):意大利Enartis公司；

2-辛醇(色谱纯)，美国Sigma公司；H3PO4、NaOH、偏重亚硫酸钠(均为分析纯):购于天津市科密欧化学试剂有限公司；费林试剂、次甲基蓝指示剂及酚酞指示剂等:均按GB/T 603-2002，《化学试剂试验方法中所用制剂及制品的制备》进行配制。

1.2 仪器与设备

TRACE 1310气相色谱仪,美国Thermo Scientific公司；ISQ型单四级杆质谱仪,美国Thermo Scientific公司；固相微萃取装置,美国Surpelco公司；色谱柱DB-WAX(60 m×2.5 mm×0.25 μm)，美国Agilent Technologies公司，Genesis 10S型紫外-可见分光光度仪，美国Thermo Scientific公司；DF-Ⅱ集热式恒温磁力搅拌器，金坛市恒丰仪器制造有限公司；TD5A-WS台式低速离心机，东莞康润实验科技有限公司；UMP-153型错流过滤机(中空纤维膜柱，0.2 μm，8 L/h)，颇尔过滤器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 美乐甜型桃红葡萄酒的酿造工艺

美乐葡萄→分选、除梗、破碎→压榨、过滤→SO2、果胶酶处理→低温浸渍→接种酵母→酒精发酵(比重降至约1.040添加酵母多糖)→酒精发酵结束(比重约为1.020)。

美乐葡萄经分选、除梗、破碎后进行压榨过滤，同时添加60 mg/L SO2、20 mg/L果胶酶，在4 ℃浸渍24 h 后，室温下回温至16 ℃，添加200 mg/L活性干酵母，进行酒精发酵，当比重下降至1.040时添加酵母多糖，下降至1.020时，采用自然澄清(ZC)、离心(LX)、错流过滤(GL)3种澄清方式处理，之后取样并在低温下密封贮存备用。

1.3.2 葡萄酒理化指标测定

总糖、总酸、挥发酸、酒精度、pH、总酚参照国家标准GB/T 15038—2006进行测定[16]。

1.3.3 色度、色调测定

参照王媛等[17]的方法并略作修改。准确吸取1 mL 酒样用蒸馏水定容至10 mL，取稀释后的酒样于1 cm光程玻璃比色皿中，并以蒸馏水为对照，分别在420、520、620 nm波长处测吸光值(A)，三者之和即为该酒样的色度值，前两者之比即为色调值。

1.3.4 生物稳定性测定

将1.3.1中经3种澄清处理的葡萄酒分别装瓶放置2个月，在此期间分别在第7、21、35、60天取样，并测定其OD600值。

1.3.5 葡萄酒挥发性成分测定

香气成分萃取和GC-MS检测条件参照鲁榕榕等[18]的方法。

定性分析：采用保留指数(RI)、NIST-11、Wiley及香精香料谱库检索对比进行定性分析。谱库比对时要求匹配度>800。

定量分析：采用内标法进行半定量分析，内标物为2-辛醇。计算如公式(1)：

各香气成分质量浓度/(μg·L-1)=

(1)

1.3.6 感官评价

1.4 数据处理与分析

利用Microsoft Office Excel 2010对试验所得数据进行基本处理和作图，使用IBM SPSS Statistics 20.0进行多因素方差分析(Duncan法，P<0.05)，并用Heml软件进行热图分析，香气物质含量结果均以平均值±标准偏差(mean±SD)表示。

2 结果与分析

2.1 三种澄清处理方法对美乐甜型桃红葡萄酒理化指标的影响

葡萄酒的理化指标是衡量葡萄酒质量好坏的最基本尺度，通常包括酒精度、残糖、总酸和挥发酸等[20]。从表1数据可知，自然澄清(ZC)、离心(LX)、错流过滤(GL)3种处理的酒样其总糖质量浓度均>45 g/L，符合甜型葡萄酒的含糖要求。同时，与ZC相比，LX和GL处理后其酒精度和挥发酸分别降低1.81%～2.11%和11.11%～13.89%，并产生显著影响(P<0.05)。考虑这可能是由于离心产热，以及错流过滤的多管道循环造成的。葡萄酒的pH和总酸指标可反映其氢离子含量与酸浓度的高低水平，并进而对酒的稳定性和感官质量起重要作用。由试验结果可知(表1)，3种澄清方式对总酸、pH作用较小，但对供试酒样的颜色影响较大。同ZC相比，经LX、GL操作后葡萄酒色调值依次减小，其中错流过滤对葡萄酒色调影响更为显著(P<0.05)，这可能是由于离心与错流过滤过程降低了葡萄酒的氧化褐变，使酒体颜色更偏向于红色色调，这与本试验中感官分析结果相吻合。色度主要反映酒体的颜色强度，其中经错流过滤后酒样的色度值最小，并与总酚含量变化趋势一致，这可能是因为葡萄酒中的某些花色苷酚在经膜过滤时被膜柱上的极性基团吸附，使得葡萄酒中总酚含量降低，色度值减小造成的[3]。

表1 各处理酒样的基本理化指标Table 1 Basic physical and chemical indicators of each treated wine sample

注:表中ZC表示自然澄清处理酒样；LX表示离心处理酒样；GL表示错流过滤处理酒样。不同字母代表差异显著(P<0.05)。下同。

2.2 三种澄清处理方法对美乐甜型桃红葡萄酒生物稳定性的影响

由于甜型葡萄酒含糖量≥45 g/L[16]，酒中残留的微生物可能在其储存过程中进行发酵，降低瓶内生物稳定性，从而影响葡萄酒品质与安全[21]。本试验通过测定2个月内葡萄酒OD600值的变化来反映其生物稳定性。由图1可知，在第0天时，3种澄清处理的酒体均为澄清状态，随着储存时间的延长，在第7天时，ZC处理的酒中出现少量絮状沉淀，其他2种处理尽管OD600值有小幅增加，但酒样外观没有明显变化。贮存第21天后，ZC处理酒样中出现明显浑浊，此时，LX处理样品也开始产生少量絮状沉淀，但GL处理的葡萄酒状态依然透明澄清。当贮藏结束时(第60天)，3种处理的酒体澄清度有显著差异，ZC和LX处理的葡萄酒中在其底部可观察到明显的酒泥沉淀，这主要是因为自然澄清和过滤操作除菌效果较差，未去除的酵母在酒中继续代谢引起的。另外，本试验还发现，经GL处理的葡萄酒虽不能达到完全除菌的效果(在储存的60 d内，OD600从最初0.021 增加到0.053)，但这并不影响葡萄酒整体的澄清度。综上，3种澄清处理方式下葡萄酒的生物稳定性差异显著(P<0.05)，其中错流过滤效果最佳。

图1 各处理酒样OD600值的变化Fig.1 Changes in OD600 values of various treated wine samples注：图中不同小写字母代表差异显著。下同。

2.3 三种澄清处理方法对美乐甜型桃红葡萄酒香气的影响

香气是评价葡萄酒品质的重要指标之一[22-23]，本试验采用顶空固相微萃取结合气相色谱-质谱联用(HS-SPME/GC-MS)技术对3种澄清方式处理酒样的香气物质进行分析，试验共检出70种香气物质(图2)，其中醇类17种(约占香气总量的24.29%)，酯类28种(约占香气总量的40%)，酸类12种(约占香气总量的17.14%)，萜烯类7种(约占香气总量的10%)，其他类6种(约占香气总量的8.57%)。

图2 各处理酒样香气成分比较Fig.2 Comparison of aroma components of each treated wine sample注：图中柱形图表示香气物质含量；折线图表示香气物质种类。

由图2可知，ZC处理酒样的香气物质含量最高、种类最多，GL处理酒样的香气物质含量最低、种类最少。与ZC处理相比，LX和GL处理的酒样香气物质总量分别降低了34.99%和66.82%，并且不同物质下降幅度也有差异，其中醇类物质含量下降较多(分别为1.20和2.21 mg/L)，酯类、酸类、萜烯类物质含量下降较小(分别为0.28～0.59 mg/L、0.19～0.30 mg/L、0.02 ～0.14 mg/L)。LX和GL处理除对香气物质含量影响较大外，经LX和GL处理后香气物质种类也分别减少18和22种，如2-壬醇、丙酸异戊酯、肉豆蔻酸异丙酯、壬酸等某些含量较低的香气物质只出现在ZC处理的葡萄酒中，这可能是因为自然澄清、离心和错流过滤3种澄清方式使发酵结束后的葡萄酒中的香气物质的种类与含量进行重新分配，进而形成了各自不同的香气品质。

2.3.1 醇类化合物

醇类化合物是酵母菌的次级代谢产物，是葡萄酒的主要香气物质之一[24]，在酒精发酵过程中由糖代谢、氨基酸脱羧和脱氢产生，其含量受发酵条件、原料品质以及产品后处理等因素的影响[25-26]。由表2可以看出，经ZC、LX和GL三种处理之后，其含量和种类依次减少，GL处理酒样减少幅度最大。自然澄清处理的葡萄酒中醇类含量为2 873.86 μg/L，相比于LX和GL，分别显著高出41.89%和77.94%(P<0.05)。本试验还发现3种处理酒样中个别物质含量也存在明显差异，如2-壬醇等含量较低的高级醇类物质只出现在自然澄清的酒样中，同时1-戊醇和正己醇等具有生青味的醇类化合物含量下降幅度较大，这减少了其带给葡萄酒的负面影响。

表2 各处理酒样醇类化合物的变化Table 2 Changes of alcohol compound in each treated wine

注：显著性差异为同一因素下的3个水平在P<0.05 时的比较，不同字母表示具有显著性差异； “-”表示样品中未检出该物质，表示未查阅到相关文献。下同。

2.3.2 酯类化合物

酯类化合物是葡萄酒中最主要的挥发性化合物，由酵母代谢以及酒中的酯化反应产生，并赋予葡萄酒花香和果香[27-28]。分析表3可知，本试验在3种处理酒样中分别检测出28种(ZC)、22种(LX)和16种(GL)酯类化合物。其中反式-3-己烯酸乙酯、肉豆蔻酸异丙酯等一些不常见的酯类化合物在LX和GL的酒样中未被检出。自然澄清处理的葡萄酒中酯类化合物总量为1 307.86 μg/L，而离心和过滤处理的酒样分别降低了21.99%和45.87%，类似的变化趋势在ARRIACADA-CARRAZANA等[1]的研究中也有报道。考虑这可能是由于膜柱对酒中挥发性物质的吸附造成的。在3种处理中贡献较大的酯类物质有乙酸异戊酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯和乙酸乙酯，它们赋予了葡萄酒一定的果香[18]，与ZC相比，LX和GL处理酒样中这些酯类物质分别降低了25.98%～64.07%、0.38%～8.07%、2.89% ～34.41%、27.06%～50.57%和9.56%～19.31%，这与本试验感官分析结果中果香风味下降幅度较大相对应。

2.3.3 酸类化合物

葡萄酒中的脂肪酸类化合物主要是酿酒酵母和乳酸菌在发酵过程中代谢的副产物，这些化合物具有油脂、酸腐以及奶酪的气息，当含量过高时，会给葡萄酒带来不良的影响[23-24]。分析表4可知，ZC处理酒样中酸类香气物质的种类和含量均多于LX和GL处理酒样，与ZC处理相比，经LX和GL处理后的酸类香气物质含量分别下降了33.33%和41.67%，且3种处理后的酸类香气物质总量之间均具有显著性差异(P<0.05)，这与3种处理酒样的挥发酸含量趋势一致，这可能是因为两者同具有挥发性，故因其性质上的相似性从而对机械处理呈现出相似的差异趋势。试验中检出的含量最高的酸类香气物质为辛酸，其可赋予葡萄酒奶酪和奶油的气味，但当其浓度过高时则会出现腐败和刺激味等异味[22]，这在感官分析中也有一定程度的体现。

表3 各处理酒样酯类化合物的变化Table 3 Changes of ester compounds in each treated wine

表4 各处理酒样酸类化合物的变化Table 4 Changes of acid compound in each treated wine

2.3.4 萜烯类化合物

萜烯类化合物作为葡萄酒的品种香气，主要以键合态的形式存在，酿造过程中在糖苷酶的作用下分解为游离态的香气物质被逐渐释放到葡萄酒中，同时赋予了葡萄酒浓郁的花香和果香[29-30]。其中芳樟醇和反式-橙花醇具有玫瑰花香和果香[31]，是葡萄酒较为重要的特征香气物质，由表5可知，经机械处理后3种单萜类化合物含量均在减少，并且ZC、LX、GL三种处理间单萜类化合物含量具有显著差异，而其他4种非单萜类萜烯化合物含量变化相对较小，这主要是因为单萜化合物相对分子质量小，挥发性比其他4种萜烯高，因而在LX和GL过程中损失较大。但这些物质均为葡萄酒中典型的萜烯类化合物，并赋予葡萄酒强烈的花果香气，增强了酒体香气的复杂性。

表5 各处理酒样萜烯类化合物的变化Table 5 Changes of terpenoid in each treated wine

2.4 香气化合物聚类热图分析

为了进一步探讨3种澄清处理对美乐甜型葡萄酒香气化合物的影响，我们将3种处理酒中检测出的所有香气物质进行热图聚类分析(图3)。其中图右侧的颜色条带梯度一一对应着左边的香气物质的种类及其含量，用以解释香气物质的分布。从图中变化可以看出，经3种澄清处理的葡萄酒香气成分有明显差异(根据热图分析可分为自然澄清以及离心和错流过滤两大类)。图中颜色由深色到浅色表明经3种澄清处理酒中香气化合物的含量和种类依次减少，因此可初步将所考察的香气物质分为 Ⅰ(A9-B10)、Ⅱ(B13-B28)和Ⅲ(C1-B20)3个系列。数据分析可知，Ⅰ系列多以癸酸乙酯、乙酸乙酯、1-壬醇、香叶醇等具有水果香味的化合物为主，与ZC相比，LX处理保留了大量的此类物质成分，但GL则会引起较多损失；Ⅱ系列主要是以乙酸苯乙酯、β-大马士酮、β-紫罗兰酮、2-壬醇等具有花香和植物气息的物质居多，不过经过处理后发现，两种机械方式间并未有明显的差别；而分析以辛酸乙酯、反式-橙花叔醇、芳樟醇、辛酸等为代表的Ⅲ系列(具有花果、动物香味)后发现，GL处理会显著降低此类香气的含量，但LX却不会产生明显影响。

综上，ZC处理酒样深色部分所占比例最多，表明此种处理对香气物质的保留具有较好的作用。而经机械处理后的样品香气物质在种类和含量均有所降低，特别是GL处理，其对香气物质的影响最大(图3浅色部分所示)。考虑这可能与错流作用时，滤膜对香气物质较高的吸附以及截留效果有关。这也与我们在试验过程中观察到的GL样品具有较低的色度，以及较高的生物稳定性相对应。但有关错流过滤对香气物质具体的作用机制仍需做进一步的研究。

图3 各处理酒样香气化合物聚类热图Fig.3 Cluster heat map of aroma samples of various treated wine samples注：A为醇类，B为酯类，C为酸类，D为萜烯类；-1～1表示化合物的含量从低到高一次增大。

2.5 三种澄清处理方法对美乐甜型桃红葡萄酒的感官影响

图4为3种澄清处理酒样感官分析雷达图。从图4可以看出，经3种处理后的酒样在异味、甜味、酸味、酒体、余味长短之间无较大差异。从外观分析可知，LX和GL的酒样澄清度明显高于ZC处理，其中GL处理澄清度最高，LX次之。然而颜色强度具有不同程度的减弱，这主要与错流过滤时膜柱的吸附有关，当葡萄酒样经过膜柱时，膜柱在吸附大颗粒悬浮物的同时，也会吸附一些大分子酚类物质，从而使酒样的色度值下降，颜色强度减弱。ARRIAGADA-CARRAZANA等[1]研究发现，经膜过滤的酒样在颜色强度和多酚分布中呈显著的降低，这与本试验的研究结果一致。从香气方面来看，ZC处理的酒样其香气的浓郁度和复杂性比较显著，并且花香、果香味较为丰富，但存在香气特征不突出的问题，而经GL和LX处理的酒样的香气特征明显，尤其是经错流过滤后的酒样其香气更加纯正、优雅。

图4 感官分析雷达图Fig.4 Radar chart of sensory analysis注：图中0～8为各指标的得分高低，表示感觉强烈程度逐渐增大。

3 结论

本试验研究了自然澄清、离心和错流过滤3种澄清方式对美乐甜型桃红葡萄酒澄清效果和挥发性品质的影响，结果表明：

(1) 3种澄清方式处理葡萄酒样其基本理化指标均符合国标要求，其中错流过滤处理酒样澄清效果最好；

(2)错流过滤虽不能达到完全除菌的效果，但在60 d的贮藏过程中其生物稳定性要高于离心和自然澄清处理。

(3)GC-MS分析发现，自然澄清处理酒样中检出的香气物质含量最高、种类最多，错流过滤处理酒样的香气物质则相对较少，含量较低。结合感官数据表明，尽管自然澄清处理的葡萄酒香气浓郁、复杂，但错流过滤处理则会使样品香气变得纯正、优雅。