不同氮源对脱胚玉米挤出物发酵生产柠檬酸的影响

叶向库，申德超

1(河北农业大学，河北 保定，071001) 2(烟台大学，山东 烟台，264005) 3(山东理工大学，山东 淄博，255091)

柠檬酸是目前世界工业用量较大的有机酸之一。食品工业中所使用的柠檬酸主要采用发酵法生产[1]，在过去的100多年中，发酵法生产柠檬酸先后使用薯干粉[2]、木薯粉[3]、淀粉[4]、葡萄糖母液[5]、糖蜜[6]、马铃薯[7]、小麦粉[8]和玉米粉[9-11]等作为原料进行生产，人们又尝试了用菠萝[12]、角豆荚[13]和甘蔗渣[14]等进行生产。在使用来源丰富的淀粉质原料生产柠檬酸时，都需要将原料中的淀粉先经糊化、液化、糖化过程水解成菌种可以利用的单糖或双糖后才能被利用。传统工厂中生产柠檬酸所用原料主要是全籽粒玉米，经粉碎、喷射液化、糖化后用黑曲霉Co827进行发酵生产柠檬酸。本文采用脱胚玉米加酶低温挤出处理后再经液化、糖化后作为原料，仍以黑曲霉Co827作为发酵菌种。实验室前期对柠檬酸生产及处理过程中的能耗以及相关的转化率进行了详细地分析，以为该法与现有方法相比，有利于玉米的综合利用，降低糊化能耗，提高柠檬酸产率，节约生产成本，提高企业的经济效益。但是由于以脱胚玉米为原料，处理后所得发酵液中蛋白质含量较低，只有约0.1%(质量分数)，不能完全满足黑曲霉发酵过程中对氮源的需要(目前以全玉米为原料，生产发酵液中控制蛋白质含量为0.7%～0.8%(质量分数)，后期需补加氮源。因此本试验考察脱胚玉米加酶低温挤出所得发酵液添加不同氮源对柠檬酸发酵过程的影响，得到脱胚玉米加酶低温挤出物适合柠檬酸发酵的氮源及添加量。

1 材料与方法

1.1 材料

全籽粒玉米，市购(水分质量分数13.7%、淀粉质量分数71.2%、蛋白质质量分数10.4%、粗脂肪质量分数4.8%)。

脱胚玉米挤出物，脱胚玉米(水分含量13.5%、淀粉含量79.68%、蛋白质含量7.56%、粗脂肪含量0.84%)在原料含水量30%、螺杆转速110 r/min、挤压时套筒温度60 ℃、添加耐高温α-淀粉酶(3×104U/mL)1.0 L/t的条件下经山东理工大学农产品加工教研室研制的单螺杆挤出机挤出得到。

菌种：黑曲霉Co827，山东莱芜泰禾生化有限公司提供。

1.2 试验方法

培养基的制备：取干燥发芽大麦用粉碎机粉碎成大麦芽粉，取适量大麦芽粉于500 mL锥形瓶中，加入3.5倍的蒸馏水用玻璃棒搅拌均匀，然后放入恒温水浴锅中于65 ℃保温糖化5～6 h，直至碘液不变蓝为止。然后保温真空过滤，得滤液用波美计调波美度到10 °Be，经121 ℃灭菌20 min冷却后备用。

发酵培养基的制备：

(1)全玉米(对照样)发酵液培养基：全玉米用粉碎机粉碎至40目筛，未通过量<15%(质量分数)即可，置于容器中加2.5倍的水，加热至90 ℃，同时每克原料加入10 U的耐高温α-淀粉酶，恒温液化至碘液不变蓝为止。取液化液保温真空抽滤，滤过液用10%(体积分数) H2SO4调pH值为4.5，按每克原料加入160 U糖化酶在60 ℃进行糖化，当DE值>90%时糖化结束。该发酵液经121 ℃灭菌20 min冷却后备用。

(2)脱胚玉米挤出物发酵液培养基：取脱胚玉米挤出物经粉碎机粉碎，置于容器中加2.5倍70 ℃热水混匀后迅速放于90 ℃水浴锅中加热，其余操作与全玉米发酵液培养基制作方法相同。

(3)菌种的活化和扩培：从斜面挑取菌种2～3环接入麦芽汁培养基中，于35 ℃、230 r/min恒温摇床上通风培养24 h，重新再活化1次，作为菌种发酵液。

柠檬酸的测定：试样离心后，上清液经0.3 μm滤膜抽滤，以(NH4)2HPO4-H3PO4缓冲溶液(pH=2.7)为流动相，流速0.8 mL/min，进样量20 μL，用C18色谱柱进行分离，紫外检测器于210 nm处测定，用峰面积标准曲线对柠檬酸进行定量。

标准曲线的绘制,以柠檬酸标准液浓度为横坐标，色谱峰峰面积均值为纵坐标，得柠檬酸标准曲线为：Y=82.172X+197.01(R2=0.999 7)。柠檬酸色谱图如图1所示。

图1 柠檬酸标准液的色谱峰形图Fig.1 Citric acid titer of chromatographic peak graph

蛋白质的测定参照GB/T 5009.5。

还原糖的测定参照GB/T 5009.7。

总糖的测定参照酸水解法。

pH的测定参照pH计测定法。

柠檬酸发酵方法：发酵液置于锥形瓶中，接入10%(体积分数)菌种，35 ℃、230 r/min恒温摇床上通风发酵72 h，取出测定柠檬酸产量。

1.3 试验内容

1.3.1 无机氮源对柠檬酸发酵过程的影响

选择NH4Cl、NH4NO3、(NH4)2SO4作为无机氮源[15-16]，分别取1、2、3 g/L的添加量进行试验。

1.3.2 有机氮源对柠檬酸发酵过程的影响

有机氮源分为外源性氮和内源性氮，外源性氮选择尿素，内源性氮选择脱胚玉米经液化、糖化后过滤的滤渣。

1.3.2.1 尿素与玉米渣的可行性试验

尿素可以促进真菌的生长，以生产发酵液总蛋白量为参考，向调整到总糖18%(质量分数)的挤出物玉米糖化液中加入质量浓度6.4 g/L的尿素进行发酵试验。

同时取18%(质量分数)挤出物玉米糖化液加入相当于质量浓度6 g/L蛋白质的玉米渣作为有机氮源进行发酵试验。

1.3.2.2 添加玉米渣对柠檬酸发酵过程的影响

按照目前生产中发酵液控制的总蛋白质含量0.7%～0.8%(质量分数)计算，向挤出物制备的发酵液中添加相当于质量浓度1、2、3、4、5、6 g/L蛋白含量的玉米渣。

2 结果与分析

2.1 无机氮源对柠檬酸发酵效果的影响

表1 不同无机氮源对柠檬酸发酵的影响Table 1 Effects of inorganic nitrogen on fermentation

由表1可以看出，向发酵底物中添加一定量的NH4Cl、(NH4)2SO4对黑曲霉发酵柠檬酸有不同程度的促进作用，其中，(NH4)2SO4促进产酸效果尤为显著，而NH4NO3促进作用不明显。对(NH4)2SO4和NH4NO3、NH4Cl数据进行t检验分析[18](表2、表3)，可以看出，t1(6)=1.616 6>t0.10(6)=1.439 8，t2(6)=1.132 8>t0.25(6)=0.717 6，相对于NH4NO3，(NH4)2SO4对黑曲霉发酵产柠檬酸的影响差异非常显著，相对于NH4Cl，(NH4)2SO4对黑曲霉发酵产柠檬酸的影响差异较显著。对比(NH4)2SO4的不同添加量可以看出，当(NH4)2SO4的添加量为3 g/L时，柠檬酸的产率最高。当(NH4)2SO4的添加量超过或者低于3 g/L时促进产酸效果减弱。这与孙荣[19]的试验结果一致。

表2 (NH4)2SO4与NH4NO3的t检验Table 2 t-test of (NH4)2SO4 and NH4NO3

表3 (NH4)2SO4与NH4Cl的t检验Table 3 t-test of (NH4)2SO4 and NH4Cl

2.2 有机氮源对柠檬酸发酵效果的影响

2.2.1 尿素与玉米渣可行性试验结果

添加有机氮源选择外源性氮和内源性氮。从工业应用的经济性角度出发，外源性氮首选尿素[10]，内源性氮选择原料经液化、糖化过滤后蛋白质含量较高的玉米渣为原料，经测定脱胚玉米挤出物经液化、糖化后过滤所得玉米渣中蛋白质含量为23.1%。可行性试验结果如表4所示。

表4 添加尿素与玉米渣的可行性试验Table 4 Feasibility test of citric acid production addingurea or corn cinder

由表4可以看出，添加尿素的发酵液样品经过72 h的发酵产生的柠檬酸只有1.61 g/100 g，镜检发现，黑曲霉菌丝球形状很好，结构紧密，也没有出现衰老死亡、孢子松散的状态，无杂菌污染，但活力很低，发酵产酸弱，不能用于柠檬酸生产中氮源的使用，具体原因尚待研究。添加玉米渣的发酵液样品经过72 h的摇床培养，产生6.45 g/100 g的柠檬酸，发酵状态比较好，镜检发现菌丝球体积明显增大，外部边缘不清晰，有松散孢子分散出来，发酵活力减弱，已到发酵终点[20]。可以说明，玉米渣可以作为有机氮源的添加物进行下一步试验。

2.2.2 添加玉米渣对柠檬酸发酵效果的影响

玉米渣为原料中原有产物，传统发酵法中为满足黑曲霉的繁殖和代谢，在发酵初需控制发酵液中蛋白质含量在0.7%～0.8%(质量分数)，脱胚玉米经加酶低温挤出后，进行液化、糖化、过滤后得到的发酵液中蛋白质含量约0.1%(质量分数)，而玉米渣中含有23.1%的蛋白质。用玉米渣补充氮源，一方面减少废弃物的排放量和处理费用，另一方面又有利于发酵生产过程的调节作用。

表5 有机氮源对柠檬酸发酵的影响Table 5 Effects of organic nitrogen on fermentation

由表5可以看出，玉米渣随着添加量的增多，发酵产酸量反而减少，呈负相关性。虽然低温加酶挤出脱胚玉米制得柠檬酸发酵液中的蛋白质含量并不高，只有约0.1%(质量分数)，远低于目前生产中使用的0.7%～0.8%(质量分数)的蛋白质含量水平，但添加质量浓度1 g/L玉米渣后柠檬酸发酵良好，经72 h发酵后产酸达到9.82 g/100 g。表明发酵液体系中有满足黑曲霉菌体生长和代谢产酸所需要的氮源。表明脱胚玉米经过加酶挤出后蛋白质受到了较彻底的破坏，部分发生降解，溶入发酵液中的游离态氮源增多，更利于菌种的吸收利用，虽然总量不多，但可以满足黑曲霉菌体生长和产酸的需要。

3 结论

(1)以脱胚玉米加酶低温挤出物制备柠檬酸发酵液，向其中添加无机氮源((NH4)2SO4、NH4NO3、NH4Cl)。结果显示，(NH4)2SO4、NH4Cl对黑曲霉发酵产柠檬酸有促进作用，其中(NH4)2SO4促进产酸效果尤为明显，当(NH4)2SO4添加量为3 g/L时，柠檬酸的产率达到7.86 g/100 g。

(2)以脱胚玉米加酶低温挤出物制备柠檬酸发酵液，向其中添加有机氮源(尿素、脱胚玉米淀粉水解后的玉米渣)发现，尿素能维持黑曲霉菌丝球良好状态，但发酵产酸能力很弱。玉米渣对黑曲霉发酵有明显影响，随着添加量的增多，发酵产酸量反而减少，呈负相关性。添加质量浓度1 g/L后柠檬酸发酵良好，经72 h发酵后产酸达到9.82 g/100 g。

(3)脱胚玉米经加酶低温挤出后制备柠檬酸发酵液，添加无机氮源和有机氮源均对柠檬酸发酵产生影响。从发酵后柠檬酸产率来看，添加有机氮源玉米渣优于添加无机氮源硫酸铵对柠檬酸发酵的促进效果。