复合酶法提取平菇多糖工艺优化

杨勇 首坤秀 李立郎 杨艳 杨小生 杨娟

摘 要：为了探究平菇多糖的提取工艺，本试验选用甘露聚糖酶、木瓜蛋白酶、纤维素酶作为提取平菇多糖的复合酶，通过正交设计试验优化复合酶用量，采用响应面优化法考察液料比、酶解温度、酶解时间、pH值四个因素对多糖提取率的影响。结果显示，复合酶的最佳用量分别为甘露聚糖酶400 U/g，木瓜蛋白酶240 U/g，纤维素酶600 U/g，最佳提取工艺条件为液料比21∶1 （mL/g），酶解温度 52.0℃，酶解时间3.1 h，pH值5.7验证试验，多糖提取率为5.90%，纯度60.91%;相比之下，热水浸提法多糖提取率为5.72%，纯度59.71%。因此，复合酶法提取可作为一种平菇多糖适宜的提取方法。

关键词：多糖;复合酶;正交设计;响应面优化法

中图分类号：R284.2

文献标识码：A

文章编号：1008-0457（2019）01-0029-06 国际DOI编码：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2019.01.006

平菇为一种大型食用真菌，又名北风菌、蚝菌等，我国平菇的栽培量位居世界第二[1]。常食平菇不仅能起到改善人体的新陈代谢，调节植物神经元的作用，而且对降低血压、减少人体血清胆固醇和防治高血压、胃溃疡、十二指肠溃疡、肝炎等有明显的效果[2-3]。

来源于平菇中的平菇多糖，含量普遍高于天然植物，产量丰富、毒副作用小，受众多研究者所青睐。在平菇营养成分中，以干重为基础，水分占9.03%～18.28%，粗蛋白占4.0%～35.97%，粗脂肪占1.9%～16.38%，總糖占16.76%～52.1%，粗纤维占3.7%～28.4%[4]。平菇多糖具有抗凝、抗细菌和抗病毒的作用，维护正常的肝功能以及提高肝脏解毒能力，提高动物耐缺氧能力和对氧的利用率，降低血液粘稠度，改善心律，增加心肌收缩力，还具有降低血糖、镇痛、镇静、止咳、化痰、平喘的功效[5]。在医疗领域，平菇多糖主要用来抑制肿瘤的发生、发展与转移，提高肿瘤对化疗药物的敏感性，改善患者的身体状况，其在治疗肺癌、胃癌、结肠癌等方面具有良好疗效[6]。现代研究发现平菇蛋白多糖体对癌细胞有很强的抑制作用，能增强机体免疫功能[7-8]。

由于平菇的活性成分主要存在于细胞质中，常规溶剂提取，需要克服来自细胞壁及细胞间质的传质阻力，才能溶解活性成分达到提取的目的。酶解法作为一种高效的提取方法，具有能耗低，提取时间短，保护目标产物免受破坏，优化有效组分，简化工艺等优点，被广泛应用于活性成分的提取。以纤维素酶、半纤维素酶和蛋白酶等酶类作为高效催化剂，利用其专一性提取其活性成分，得到产物稳定、纯度高、活性好。基于此，本试验运用正交设计优化复合酶用量，同时通过响应面法优化提取工艺条件，以期为相关药食同源的产品开发提供应用依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

平菇（以药渣作为培养基质栽培出菇，贵州省中国科学院天然产物化学重点实验室提供）;透析袋（分子截留量 14000，上海绿鸟科技发展有限公司）;纤维素酶（50000 U/g，上海源叶生物科技有限公司）、甘露聚糖酶（50000 U/g，上海源叶生物科技有限公司），木瓜蛋白酶（200000 U/g，天津利华酶制剂技术有限公司），磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、葡萄糖、正丁醇、氯仿、浓硫酸、苯酚、无水乙醇均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

TCL-16B离心机（上海安亭科学仪器厂），XP-200高速中药粉碎机（吉首市中诚制药机械厂），GZX-9023电热鼓风干燥箱（上海博讯实业有限公司），SY2000旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂），SHB-B88真空泵（郑州长城科工贸有限公司），DK-98-11恒温水浴锅（天津泰斯特仪器有限公司），AG285梅特勒-托利电子分析天平（Mettler Toledo公司），UV-1800紫外可见分光光度计（岛津仪器（苏州）有限公司），SH2-88水浴恒温振荡器（太仓市实验设备厂），Millipore-0026型超纯水机（美国密理博公司）。

1.3 方法

1.3.1 复合酶法提取平菇多糖工艺流程

平菇→洗净→晾干、烘干→打粉→称取适量的样品烘干至恒重→按20∶1（mL/g）的液料比加入复合酶的磷酸盐缓冲溶液→在一定温度下水浴恒温酶解一定时间→然后置于沸水浴中灭酶10 min→抽滤，离心，取上清液减压浓缩至一定体积→加Sevage试剂脱蛋白[9]，混合，振荡，离心→取上清液透析36 h→减压浓缩至一定的体积，加入一定量的乙醇，使溶液中乙醇终浓度达到80%→4℃静置过夜，抽滤，用无水乙醇洗涤沉淀3次→把沉淀转移至事先称重的干燥瓶中→60℃真空干燥至恒重，称重→计算平菇多糖提取率[10]。

1.3.2 复合酶用量的确定

1.3.2.1 单因素实验

平菇干粉17份，每份5 g，减压干燥至恒重，以三种不同的酶分别作为三个单因素，分别将不同用量的甘露聚糖酶、木瓜蛋白酶、纤维素酶，用100 mL NaH2PO4-Na2HPO4缓冲液溶解，搅拌，加入底物（平菇干粉）中，在一定温度下，酶解2 h，进行复合酶用量单因素考察。

1.3.2.2 复合酶用量正交试验优化 在上述单因素试验基础上，以甘露聚糖酶用量（A）、木瓜蛋白酶用量（B）、纤维素酶用量（C）分别为三个因素，采用L9（33）正交表设计正交试验，以平菇多糖提取率为指标，确定复合酶的最佳用量。

1.3.3 复合酶法提取条件的优化

1.3.3.1 单因素试验 在其他条件相同的前提下分别研究液料比、酶解温度、酶解时间、pH值对平菇多糖提取得率的影响（因素水平设计见表1）。

1.3.3.2 响应面分析

采用响应面优化法[11]设计中心组合试验，在单因素试验的基础上，考察液料比、酶解温度、酶解时间、pH 值4个对多糖提取率影响显著的因素，以平菇多糖提取率为响应值，进行响应面分析，因素水平表见表1。

1.3.3.3 多糖含量测定 以葡萄糖为标准品，采用硫酸-苯酚法测定多糖含量[12-13]。

1.3.3.4 多糖纯度与提取率的计算公式

2 结果与分析

2.1 复合酶用量的确定

2.1.1 单因素试验结果与分析

甘露聚糖酶用量（A）的最佳选择梯度范围为200～600 U/g;木瓜蛋白酶用量（B）的最佳选择的梯度范围为200～280 U/g;纤维素酶用量（C）的最佳选择的梯度范围为400～800 U/g。

2.1.2 复合酶用量正交试验结果与分析 从正交试验结果（表2）得出，三种因素影响多糖提取率的大小分别为B> C > A，即木瓜蛋白酶>纤维素酶>甘露聚糖酶，复合酶最佳酶用量组合为：A2B2C2，即甘露聚糖酶400 U/g，木瓜蛋白酶240 U/g，纤维素酶600 U/g。以正交设计优化的复合酶用量为参照，经4组平行试验，验证得平菇多糖提取率为5.66%，大于复合酶用量单因素考察时，平菇多糖提取率最大值5.37%。

2.2 复合酶法提取最优条件的确定

2.2.1 单因素试验的结果与分析

在单因素试验考察的基础上，应用响应面法筛選的液料比梯度范围为15～25 mL/g;应用响应面法筛选的温度梯度范围为40～60℃;应用响应面筛选的酶解时间梯度范围为2.0～4.0 h;应用响应面筛选的pH值梯度范围为4.5～6.5。因素水平见表1。

2.2.2 响应面分析的结果 采用Design-Expert 8.05b软件对响应值与各因素进行回归拟合后，得到回归方程：

Y= -63.94323 + 0.59007A + 1.26718B + 5.28534C + 7.90087D + 2.04226×10-3AB + 2.91752×10-3AC + 2.1752×10-2AD - 1.5566×10-2BC + 1.08945×10-2BD - 0.12538CD - 1.9919×10-2A2 - 1.2185×10-2B2 -0.61698C2 - 0.70348D2，该方程R2=0.9868，表明方程的可信度较好，能够分析和预测多糖的提取工艺[14-16]。

由表4回归分析的结果表明，该模型的F值为80.35，表示其能达到极显著差异（P<0.001），说明该模型具有统计学意义。与纯误差正相关的失拟项的F值为2.82，不显著（P>0.05），说明本方法与实际试验差异较小，拟合程度较好，预测值能符合实际检验结果。回归方程各项的方差分析结果还表明，酶解温度（B）、酶解时间（C）、pH值（D）一次项式能达到极显著水平（P<0.001），而液料比（A）一次项式仅达到非常显著水平（0.001<P<0.01），说明B、C、D三个因素对多糖提取率有极显著影响，而A对多糖提取率有高度显著影响。根据F值判断，四个因素对多糖提取率的影响程度为：B > D > C > A。此外，B与C交互项能达到显著水平（P < 0.05），说明酶解温度与酶解时间之间交联影响显著。

2.2.3 验证试验

依据响应面法优化得到的最佳提取工艺条件为液料比20.82∶1（mL/g）、酶解温度52.01℃、酶解时间3.10 h、pH值5.70，综合实验室设备精度情况，将优化提取条件修正为液料比21∶1（mL/g），酶解温度52.0℃，酶解时间3.1 h，pH值5.7。在该条件下平行测定5次，多糖提取率为5.90%，大于未优化提取条件（液料比20∶1（mL/g）、酶解温度55℃、酶解时间2.0 h、pH值5.5）的测定结果5.66%。因此，证明本方法首先通过正交优化复合酶的适宜用量，其次通过响应面优化提取工艺条件，能提高平菇多糖的提取率。

2.2.4 复合酶法与热水浸提法多糖提取率比较

与热水浸提法提取平菇多糖[17]对比，同样平行操作5次，计算多糖纯度与提取率。与此同时，以不加酶且在优化的最佳条件下，提取平菇多糖的对照组作为空白对照组。

实验结果表明（见表5），前两种提取方法的多糖提取率均远大于空白对照组，前两组多糖提取率接近。三组多糖纯度接近，但在温和的提取条件下得到多糖纯度更高，尽管纯度数值上相差不大，但热水浸提得到的粗多糖与另外两组在色泽上有明显差异，颜色太深会干扰多糖定量分析的最终结果，造成较大实验误差。

3 结论与讨论

本试验通过正交设计优化离散型变量，即筛选复合酶的适宜用量，结果显示，三种酶分别影响平菇多糖提取率的大小为：木瓜蛋白酶>纤维素酶>甘露聚糖酶，最佳复合酶用量为甘露聚糖酶400 U/g，木瓜蛋白酶240 U/g，纤维素酶600 U/g。其次通过响应面优化法优化连续型变量，即提取条件工艺参数，并考察各个因素（提取条件）对多糖提取率的影响，探究平菇多糖的最佳提取工艺条件，运用响应面法构建了各个条件对平菇多糖提取率影响程度的模型，发现液料比、酶解温度、酶解时间、pH值均对平菇多糖的提取有显著影响，影响高低程度依次为：酶解温度>pH值>酶解时间>液料比，响应面优化结果经修正，最佳提取工艺条件为液料比21 mL/g，酶解温度52.0℃，酶解时间3.1 h，pH值5.7，经验证，该条件下多糖提取率为5.90%，高于热水浸提组和空白对照组。尽管这两者多糖提取率值接近，但综合考虑能耗和产物纯度方面，复合酶提取方法相对较优，可作为一种平菇多糖适宜的提取方法。

平菇中含有大量的多糖，比如纤维素、半纤维素、几丁质等，由于这些多糖难于降解，当前对平菇多糖的利用率仍然处于较低水平。因此，本试验通过正交设计-响应面优化法优化的平菇多糖提取工艺，能提高平菇多糖的提取率与纯度，以满足高精度分析定量的要求，为更好地开发平菇的药用价值和评估平菇对培养基质中碳源的利用程度，提供一定的理论依据。

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