分离自土壤Paraboeremia属真菌一新记录种

王坤英 姜于兰

摘 要：采集贵州贵阳花溪湿地公园山林土壤，分离得到Paraboeremia属真菌一新记录种，对该种结合形态特征及分子系统学分析基于ITS，LSU，rpb2和tub四个基因片段，在系统进化树上，该标本HGUP1801与采自荷兰卷柏叶片上的Paraboeremia selaginellae聚集在一起，并且形成很高的支持率，将该种定名为Paraboeremia selaginellae。研究标本保存在贵州大学植物病理学实验室（HGUP）。

关键词：亚隔孢壳科;形态学;分子系统学;分类

中图分类号：S432.1

文献标识码：A

文章编号：1008-0457（2019）01-0006-04 国际DOI编码：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2019.01.002

Paraboeremia Q.Chen & L.Cai属于Ascomycota子囊菌门，座囊菌纲Dothideomycetes，格孢腔菌目Pleosporales，亚隔孢壳科Didymellaceae。截止目前，该属已报道6种，包括3个新组合种，新组合种是由茎点霉属Phoma Fr.和茎点霉属的有性属亚隔孢壳属Didymella Sacc.移入该属[1]。Chen等[1]以Paraboeremia selaginellae为模式种建立该属，其中包括Paraboeremia adianticola和Paraboeremia putaminum两个结合新种。 Jiang等[2]报道了Paraboeremia属的三个新种，Paraboeremia camelliae、P.litseae和P.oligotrophica。

茎点霉属由Fries（1821）建立，该属真菌是一类重要的植物病原菌，分布广泛且具有丰富的多样性，主要引起植物叶片及茎杆上的病斑，可导致作物产量严重损失，其中一些物种还被列为检疫性真菌，对该属真菌进行准确的分类鉴定非常重要[3]。但传统上区分该属的形态特征相当有限，主要包括分生孢子器、產孢细胞和分生孢子的形状和大小，而这些相对简单的无性形态特征不足以对相似的不同物种进行辨别。至2004年，在MycoBank中已记录有3000多个茎点霉属的物种名称。究其原因，除了形态特征在物种区分的局限性外，使用传统的寄主相关命名法也是产生如此大量名称的重要原因。

近些年来，分子系统学技术融入茎点霉属Phoma、种以及近似属、种的分类鉴定中[1，3-5]。De Gruyter等[6]根据对茎点霉属和相关无性属分子系统学的研究结果，对茎点霉属复合群进行了重新划分，根据模式属Didymella建立亚隔孢壳科Didymellaceae，包括了广义茎点霉和其他相关属。Aveskamp等[3]研究同样发现，茎点霉属是一个多系类群，传统分类上归于该属的物种在系统发育研究中分散在至少6个科中，他们通过进一步研究建议，以茎点霉属模式种草茎点霉Phoma herbarum Westend.所在的单系分支作为狭义茎点霉属，归属于亚隔孢壳科，包含茎点霉属、壳二孢属Ascochyta Libert、亚隔孢壳属 Didymella等重要病原真菌类群。De Gruyter等和Aveskamp等[7-8]通过系统学分析对茎点霉属内物种的分类地位做了部分修订，在澄清亚隔孢壳科内属间关系上已有重要进展，但仍有较多物种的分类情况尚未解决。Chen等根据形态特征的观察以及基于LSU，ITS，tub2和rpb2四个序列位点的系统发育学分析，将亚隔孢壳科划分为17个有较高支持率的单系属，包括Paraboeremia等9个新属。Paraboeremia属真菌分布广泛，可生存于腐生的叶片、土壤、岩石块、发病叶片、果树的根际周围等[2，9]。该属的形态特征是产孢细胞球形或翁形，分生孢子无隔，具油滴，椭球形，直或弯曲，无色透明至浅绿。作者在土壤真菌调查中，分离获得一株疑似茎点霉属真菌，依据其他研究者对于该属及相似属研究中采用的基因条形码[10]，选择ITS、LSU、tub、rpb2四个基因片段，利用多基因系统发育分析结合形态分类方法对该菌株进行系统分类研究。

1 材料与方法

1.1 土壤采集

实验材料采自贵阳花溪湿地公园山林土，未被破坏松树林土壤将采集的研究标本置于塑料袋或牛皮纸袋，贴标签（注明采集地、采集时间、植被、土壤类型、海拔、经纬度等信息）后密封。

1.2 土壤真菌的分离纯化、保存

每份土样称取10 g，稀释100倍后涂抹于孟加拉红培养基上，每份土样3个重复分别于常温培养箱内培养4～7 d后，挑取单菌落于含有青霉素的PDA平板上，获得纯菌种，无菌操作。无菌水冷存管保存：将经适宜培养的菌种块（3～4块）置于盛有灭菌水的冷存管中，密封后置于4℃～10℃的冰箱中，每一菌种4个备份，无菌操作。分离菌株保存在贵州大学植物病理学实验室（HGUP），菌株号为HGUP1801。

1.3 形态鉴定

将保存的菌株活化，接种到产孢培养基上（OA），待菌株产孢。然后使用OLYMPUSBH体视镜制片，使用OLYMPUSBH照相显微镜进行拍照。

1.4 DNA提取和PCR反应

菌株总DNA提取自纯培养物：用灭菌的手术刀刮取2～3 w的纯培养物菌丝体50 mg，按真菌DNA试剂盒Fungal gDNA Kit GD2416（Biomiga 公司生产）说明书提取，获得的DNA溶液置于-20℃冰箱保存备用。选择引物ITS4/ITS5[11]，LROR/LR5[12]，RPB2-5F/RPB2-7cR[13]和TUB2Fd/TUB4Rd[6]。本研究使用25 μL PCR反应体系，包括：正反向引物各1 μL，DNA模板1 μL，ddH2O 9.5 μL，2xPCR Master Mix 12.5 μL。将该种所获得的DNA序列上传至GenBank（表1）。

1.5 系统进化树的构建

将用于建树的Fasta文件（14个序列），经Bioedit进行序列比对及手工校正后，保存为Fasta格式。将Fasta格式文件在网络软件ALTER（Alignment Transformation EnviRonment，http：//sing.ei.uvigo.es/ALTER/）中转换为PHY格式;基于CIPRES SCIENCE GATEWAY （http：//www.phylo.org/）网络平台，使用RAxML-HPC BlackBox（8.2.10）软件，构建ML系统发育树，使用Treeview软件查看tree格式文件，在AI（Adobe Illustrator CS5）软件编辑菌株号和自举支持率。

2 结果与分析

2.1 系统发育分析

以Vacuiphoma bulgarica（CBS 357.84）为外群的加合基因树中，Paraboeremia属以100%的支持率分成两支，分子系统学研究表明Paraboeremia selaginellae HGUP1801以94%的支持率与P.selaginellae CBS122.93聚集形成一支。

2.2 形态描述

在燕麦（OA）培养基上，菌落生长较快，圆形，具大量透明、絮状气生菌丝，分生孢子器埋生或半埋生在靠近边缘的同心环上，灰橄榄色，背面同色，27℃培养2 w，直径达4 cm。分生孢子器黑棕色，单生，球形，近球形或翁形，埋生或半埋生，具有单个孔口，100～270 μm× 100～240 μm，分生孢子器壁拟薄壁组织状，壁厚，由透明棕色细胞构成，3～4层细胞，外1～2层呈棕色，厚度达13.4～16.3 μm。分生孢子单胞，圆柱形至椭圆形，平滑，绿色，偶尔轻微弯曲，2.5～4 × 1 ～2 μm，具1～2个油滴。

采自贵阳花溪湿地公园山林土，106°E，26°N，海拔1140 m。采集时间：2017年8月，采集人：王坤英，菌株号：HGUP1801。

3 結论与讨论

目前全世界报道Paraboeremia属6个种，由于原始标本的丢失，在荷兰卷柏（Selaginella sp.）叶片上分离得到新的模式标本[14]。在系统发育树上，采自我国贵州贵阳花溪山林土的Paraboeremia与采自荷兰卷柏叶片上的Paraboeremia selaginellae聚集在一起，且二者具有相同的形态特征，分生孢子大小相似（2.5～4 × 1～2 μm  VS 2.5～5 × 1～2 μm），但采自荷兰卷柏叶片上的Paraboeremia selaginellae具有较大的分生孢子器（130～360×120～320 μm  VS 100～270×100～240 μm）。

本文菌株采自贵州贵阳花溪湿地公园山地土，花溪湿地公园是典型的城市湿地，具有河流、农田和库塘等多类型湿地，生物多样，生态良好，属于亚热带湿润气候。土壤微生物生物量的多少是土壤活性大小的标志[15]，研究土壤微生物具有重要的意义。

综上所述，该研究中采自中国贵州的Paraboeremia的标本在形态上和系统发育上均与Paraboeremia selaginellae相同，因此，鉴定该标本的分类地位为Paraboeremia selaginellae （Sacc.）Q.Chen & L.Cai。

参 考 文 献：

[1] Chen Q，Jiang JR，Zhang GZ，et al.Resolving the Phoma enigma[J].Studies in Mycology，2015（82）：137-217.

[2] Jiang JR，Chen Q，Cai L.Polyphasic characterisation of three novel species of Paraboeremia[J].Mycological Progress，2016，16（4）：285-295.

[3] Aveslcamp MM，de Gruyter J，Woudenberg JHC，et al.Highlights of the Didymellaceae：A polyphasic approach to characterise Phoma and related pleosporalean genera[J].Studies in Mycology，2010，65（1）：1-60.

[4] Aveskamp MM，deGruyter J，Crous PW，Biology and recent developments in the systematics of Phoma.a complex genus of major quarantine significance[J].Fungal Diversity，2008（31）：1-18.

[5] de Gruyter J，Woudenberg JHC，Aveslcamp MM，et al.Molecular phylogeny of Phoma and allied anamorph genera：Towards a reclassification of the Phoma complex[J].Mycological Research，2009，113（4）：508-519.

[6] Aveskamp MM，Johannes DG，Monica AM，et al.DNA phylogeny reveals polyphyly of Phoma section Peyronellaea and multiple taxonomic novelties[J].Mycologia，2009，101（3）：363-382.

[7] De Gruyter J，Woudenberg JHC，Aveskamp MM，et al.Systematic reappraisal of species in Phoma section Paraphoma，Pyrenochaeta and Pleurophoma[J].Mycologia，2010，102（5）：1066-1081.

[8] De Gruyter J，Woudenberg JHC，Aveskamp MM，et al.Redisposition of phoma-like anamorphs in Pleosporales[J].Studies in Mycology，2012（75）：1-36.

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