p53-EGFP表达载体的构建及其对A549的影响

胡昌亮 尹志刚 俸婷婷 周英

摘 要：构建具有EGFP标签的抑癌基因p53表达载体，并验证其对肺癌细胞A549的影响。以质粒pcDNA3.1-p53为模板，设计引物并进行PCR扩增获得目的基因p53，将获得的目的基因克隆至载体pcDNA3.1-EGFP上，用琼脂糖凝胶电泳检测目的条带，双酶切以及测序验证。将克隆好的载体，利用脂质体法转染A549细胞，荧光显微镜下观察，同时用MTT法测不同时间段细胞OD值。结果表明，琼脂糖凝胶电泳结果显示，目的基因扩增成功。双酶切及DNA测序结果均证实，成功构建了载体pcDNA3.1-EGFP-p53。转染A549细胞后，荧光显微镜下观察到绿色荧光。MTT法测定结果表明，目的基因转染的A549细胞组所测得的OD值明显低于对照组（p<0.01）。因此，具有EGFP标签的抑癌基因p53表达载体pcDNA3.1-EGFP-p53构建成功，转染A549细胞后，对A549细胞具有一定抑制作用。为后续继续研究p53-MDM2 生物发光能量共振转移作用奠定了基础。

关键词：EGFP;抑癌基因;p53;表达载体;A549细胞

中图分类号：Q786

文献标识码：A

文章编号：1008-0457（2019）01-0001-05 国际DOI编码：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2019.01.001

肿瘤被作为多基因疾病，如果控制细胞分化的基因发生缺陷或变异，就会导致生长调节的失控，加上一连串的变异，包括失去修补基因错误的功能以及逃离监控错误的机制，形成失去秩序的组织等[1]，这些基因可为肿瘤基因，也可为肿瘤抑制基因。研究发现，与人类肿瘤相关性最高的肿瘤抑制基因是p53基因，超过50%的癌症发生与其相关[2]，因其编码一种分子质量大约为53KDa的蛋白质而得名，在DNA转录、细胞生长和增殖以及许多代谢过程中有重要作用，能够有效地对抗组织增生，促进细胞凋亡，具有维持基因组稳定、抑制或阻止细胞转化的功能，从而抑制肿瘤的发生[3]。

p53位于人体17号染色体上，包含了11个外显子和10个内含子，序列长度大约为20 kb[4]，它编码的p53蛋白含有393个氨基酸残基，即被1182 bp基因序列编码合成。张兆新等[5]利用EGFP荧光报告表达载体构建了BRET模型，从而筛选出抑制p53-MDM2结合的小分子化合物，为治疗肿瘤寻找了可能。本文通过将p53抑癌基因克隆至含EGFP的荧光报告基因表达载体上，并将其转染至肺癌细胞A549中，观察其是否荧光表达及其对A549细胞的影响，为后续研究p53-MDM2互作BRET（生物素发光能量共振转移）模型，筛选出具有抗肿瘤作用的小分子抑制剂奠定了重要基础。

1 材料与方法

1.1 质粒、菌株和细胞

pcDNA3.1-p53、pcDNA3.1-EGFP质粒以及大肠杆菌Dh5α 均由本实验保存。肺癌细胞 A549购于中国昆明细胞库，细胞培养液为添加了10%胎牛血清、1%青链霉素混合液以及1%谷氨酰胺的RPIM1640 培养基。

1.2 主要试剂

DNA限制性内切酶、DNA连接酶购自Takara公司;DNA胶回收试剂盒购自四川成都福际生物有限公司;质粒小提取试剂盒购于天根生物;去内毒素质粒中提试剂盒购自OMEGA;LipofectamineTM 3000转染试剂、Taq DNA聚合酶、dNTP购自Takara公司;RIPM1640培养基购自Gibico公司。其余试剂均为国产分析纯。

1.3 主要仪器

PCR扩增仪、稳压电泳仪及电泳槽（美国 Bio-Rad公司）;超低温高速离心机（Eppendoff 公司）;CO2 培养箱（3111，Thermo Fisher Scientific）;倒置荧光显微镜（徕卡）;微波炉（美的）;多功能酶标仪（Thermo Fisher Scientific Oy）;超净工作台（SW-CJ-1FD，苏州净化设备有限公司）等。

1.4 引物设计与合成

根据NCBI中p53基因序列，应用Primer Premier 5.0软件设计特异性引物，5’端分别添加Hind Ⅲ和BamHⅠ酶切位点，由上海英骏公司合成。

上游引物：5’-CCCAAGCTTATGGAGGAGCCGCAGTCAGAT

下游引物：5’-CGCGGATCCTCAGTCTGAGTCAGGCCCTTCTG 。

1.5 pcDNA3.1-EGFP-p53表达载体构建

获取目的基因：利用质粒小提取試剂盒对含pcDNA3.1-p53菌液进行质粒提取，以此质粒作为PCR扩增模板。扩增体系为：模板DNA（10 pg-30 ng）10 μM，上下游引物各2 μL，2×Phanta Max Master Mix 25 μL，ddH2O补至50 μL;反应程序：95℃预变性30 s;95℃变性15 s，63℃退火15 s，72℃延伸60 s，34次循环;72℃彻底延伸5 min，终止反应。

基因克隆：胶回收纯化PCR产物，用Takara快切酶进行双酶切，再次胶回，得到最终连接所需目的基因产物，并将其克隆到载体pcDNA3.1-EGFP上。按照以下体系进行连接反应：10×ligation buffer 2 μL，载体DNA 50 ng，目的基因p53（与载体DNA的摩尔比约为3），T4 DNA Ligase（350U/μL）1 μL，灭菌水补至20 μL，4℃过夜反应，取部分连接液进行转化。挑取单菌落进行液体培养基扩大培养后菌落PCR和提取质粒双酶切验证，得到阳性克隆菌液送至上海英骏公司进行测序。

1.6 利用脂质体法将pcDNA3.1-EGFP-p53质粒转染A549细胞

采用LipofectamineTM 3000法转染真核细胞A549，该方法避免了后续细胞培养需要更换无血清培养基。按试剂盒操作说明书进行，转染前用胰酶消化细胞，用适量完全培养基按2.5×105个细胞/孔的密度平铺于6孔板，置于含有5%CO237℃的细胞培养箱中进行培养，待细胞至70%～90%汇合度时转染。将6孔板分为三组，分别是空白对照组（不进行任何转染）、阴性对照组（转染空载体pcDNA3.1-EGFP）、实验组（含目的基因pcDNA3.1-EGFP-p53质粒）。转染完成后24 h开始在荧光显微镜下观察各组荧光情况[6]。

1.7 MTT法检测pcDNA3.1-EGFP-p53质粒转染A549细胞12 h，24 h，36 h，48 h，60 h，72 h后的影响

（1）复苏培养A549细胞，保持细胞状态良好;（2）接种细胞5×104个/孔密度于24孔板中，每孔加入400 μL（设3个复孔），按上面的方法分为三个实验组，至70%～90%汇合度时转染;（3）参照LipofectamineTM 3000操作说明和要求进行转染实验;（4）分别在转染12 h，24 h，36 h，48 h，60 h，72 h后，每孔加入50 μLMTT溶液（5 mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4h后，在显微镜下观察到结晶体，弃掉上清液，加入400 μL DMSO溶液;（5）37℃摇床上缓慢摇10 min，待晶体溶解;（6）实验组和对照组每孔分三个，分装到96孔板的小孔里，使用酶标仪，在490 nm 处检测吸光度[6]。

1.8 统计学处理

采用 SPSS 22.0 软件进行处理。计量资料均用均数±标准差（X±S）表示。两样本均数比较采用t 检验，多个样本均数比较采用单因素方差分析，检验水准：P <0.05 为差异显著，P<0.01 为差异极显著。

2 结果与分析

2.1 p53基因的PCR扩增与鉴定

琼脂糖凝胶电泳结果显示，挑取的3个单菌落做菌落PCR均在约1200 bp处出现特异性条带，与预期大小（1182 bp）大小一致，初步说明目的基因已连接到目的载体上且转化成功。

2.2 重组载体pcDNA3.1-EGFP-p53的双酶切鉴定

经过双酶切表明，出现1182 bp和超过2000 bp（载体大小为6119 bp）两条条带，与预期目的片段大小一致，进一步表明此重组载体构建成功，将阳性质粒送公司测序后经NCBI BLAST后，结果为目的片段。

2.3 质粒pcDNA3.1-EGFP和质粒pcDNA3.1-EGFP-p53转染A549细胞后荧光显微镜下不同时间段观察结果

转染后，能清晰的观察到对照组有明显的绿色荧光产生，说明空载体转染成功。与对照组相比，实验组绿色荧光相对较弱，通过观察荧光，检测p53基因是否成功转入A549细胞，还能观察到不同时间段p53對A549细胞增殖的作用。在24 h开始出现微弱绿色荧光，可能由于转染时间较短造成。在36 h开始荧光强度逐渐增强，其中48 h时达到了最强，后又逐渐变弱，由此可以说明目的质粒转染成功。

2.4 MTT法测pcDNA3.1-EGFP-p53转染A549细胞后不同时间段OD值变化

转染pcDNA3.1-EGFP-p53质粒的细胞株和对照组的OD值变化表明：获得性表达外源p53基因的A549细胞，从24 h开始，其生长速度明显低于转染含EGFP空载体对照组（P <0.01），其生长明显受到抑制。转染的空载体和含p53基因目的质粒从24 h开始检测起，均与空白细胞组呈显著性差异（P <0.01）。

3 结论与讨论

本实验以肺癌细胞A549作为研究对象，成功构建具有EGFP标签的抑癌基因p53表达载体，通过荧光显微镜观察到，在转染pcDNA3.1-EGFP和pcDNA3.1-EGFP-p53的A549细胞中均可观察到绿色荧光。但由于构建的目的载体中抑癌基因p53位于EGFP上游，所以pcDNA3.1-EGFP-p53的荧光比pcDNA3.1-EGFP的荧光弱。通过MTT法测得不同时间段p53对肺癌细胞A549的影响（P <0.01），与对照组相比，初步说明p53对A549具有一定抑制作用。为后续深入研究寻找激活p53小分子化合物构建p53-MDM2互作BRET模型奠定了基础。

p53与EGFP融合表达，作为目前荧光报告基因研究的热点[7]，可以通过荧光观察判断目的基因是否表达，无需损伤细胞即可研究细胞内事件增强型绿色荧光蛋白（EGFP）作为应用最多的发光蛋白，510 nm处左右自行发射绿色荧光，无需辅助因子和底物，适于基因转录动力学研究和高通量筛选，尤其适用于基因转移的定性研究。绿色荧光的激发波长为蓝光波长，因此可用蓝光波长激发绿色荧光，观察其表达情况。

癌症是当今世界严重威胁人类生活水平和人类健康的主要原因之一，也是困扰了人们多年的生物学和医学难题[8]。研究发现，p53作为控制保护细胞恶性转移主要通路的肿瘤抑制因子，具有抑制或阻止细胞增殖和转化、维持基因组稳定的功能;mdm2 是 p53 的主要调节因子，其表达产物 MDM2 蛋白可与 p53蛋白结合而抑制 p53 的正常生物学功能，从而诱导肿瘤的发生和发展。目前以研究p53-MDM2作为癌症治疗的一个新靶点，胡纯琦[1]、李翔[9]等课题组利用此靶点进行了小分子抑制剂的筛选，其主要使用的是荧光偏振作用筛选。本课题为了更好寻找抑制p53-MDM2结合的小分子试剂，提出了构建p53-MDM2互作的BRET模型[10-14]，其中p53-EGFP融合表达是关键一步，为后续高效筛选小分子化合物提供了基础。

参 考 文 献：

[1] 胡纯琦.p53-MDM2结合抑制剂的设计、合成及生物学活性评价[D].杭州：浙江大学，2012.

[2] 李洪斌.Slug对P53-MDM2系统的调控作用[D].天津：河北工业大学，2011.

[3] 王 炎，李 琦，范忠泽，等.丹参酮ⅡA介导p38MAPK信号转导诱导人肝癌细胞凋亡[J].世界华人消化杂志，2009，17（2）：124-129.

[4] Vogelstein B，Lane D，Levine A J.Surfing the p53 network[J].Nature，2000，408（6810）：307-310.

[5] 张兆新.p53-mdm2相互作用小分子抑制剂的筛选[D].上海：华东师范大学，2014.

[6] 宝梅英.在A549细胞中重组表达具有EGFP标签的抑癌因子LKB1及对细胞生长和p53蛋白水平的影响[D].呼和浩特：内蒙古大学，2012.

[7] 郭学双.含双荧光报告基因的转基因载体的应用[D].苏州：苏州大学，2010.

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