连翘酯苷A对嗜水气单胞菌耐恩诺沙星的延缓效果及其外排作用

董亚萍 冯东岳 孙晶 张小明 胡鲲

摘要：【目的】明确连翘有效成分延缓嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）对恩诺沙星的耐药性及其对药物主动外排作用中耐药节结化细胞分化家族（RND）相关基因表达的影响，为明确连翘延缓氟喹诺酮类药物耐药性的有效成分及揭示其延缓机制提供参考依据。【方法】观测连翘提取液及其与恩诺沙星联合作用对嗜水气单胞菌耐药菌株生长的影响，测定连翘有效成分（连翘苷、连翘酯苷A和连翘酯苷B）作用于嗜水气单胞菌前后的最小抑菌浓度（MIC），并利用实时荧光定量PCR检测连翘脂苷A作用于嗜水气单胞菌耐药菌株后RND相关基因（aheA、aheB和aheC）的表达变化。【结果】连翘提取液与64 μg/mL恩诺沙星联合作用下，连翘提取液对嗜水气单胞菌耐药菌株的MIC为3.12 μg/mL;在MIC和2MIC的条件下，连翘提取液与恩诺沙星联合作用能有效抑制嗜水气单胞菌耐药菌株的生长，24 h内未见明显的生长趋势。连翘的3种有效成分对嗜水气单胞菌耐药菌株均表现出抑制作用，在1.00 μg/mL浓度条件下，连翘脂苷A的整体抑制效果较连翘苷和连翘脂苷B的效果更好。以1.00 μg/mL连翘脂苷A作用于嗜水气单胞菌耐药菌株后，aheA、aheB和aheC基因均呈不同程度的下调表达，其中aheA基因的相对表达量较连翘脂苷A作用前显著下降（P<0.05）。【结论】连翘提取液与适宜浓度的恩诺沙星联合使用对嗜水气单胞菌有明显抑制效果，同时能延缓嗜水气单胞菌的耐药性，其中又以连翘脂苷A对RND主动外排系统的抑制作用最明显。

关键词： 连翘酯苷A;嗜水气单胞菌;恩诺沙星;耐药性;耐药节结化细胞分化家族（RND）

中图分类号： S948                        文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2019）01-0187-07

0 引言

【研究意义】随着氟喹诺酮类药物在水产养殖中的广泛使用，其耐药问题越来越严重，且该类药物在细菌体内的主动外排作用极易导致细菌产生多重耐药（明德松和邓勇，2013;李帆等，2018）。与细菌主动外排作用相关的超家族共有5个（Kerr，2002;Piddock，2006;Murakami et al.，2006），分别是ATP 结合盒超家族（ABC）、小多药耐药家族（SMR）、主要易化子超家族（MF）、多药及毒性化合物外排家族（NATE）和耐药节结化细胞分化家族（RND）。AcrB是RND家族外排泵中的一个主要耐药蛋白，位于细胞内膜上。在膜融合蛋白（AcrA）和外膜通道蛋白（TolC）的协助下，AcrB蛋白通过自身提供的能量选择性将细胞内物质排出到细胞质周围，同时在AcrA 蛋白的协助下传递给TolC，进而将药物分子彻底排出细胞外（Murakami et al.，2006）。这种外排泵方式即为大肠杆菌（Escherichia coli）多重耐药性的主要耐药机制，其作用底物大多為四环素类和氟喹诺酮类药物（田亚凯，2018）。嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）是水产养殖中的主要致病菌之一，能引起水产养殖动物急性出血性败血症而大批量死亡，且耐药问题日趋严重，但至今有关外排泵RND耐药机制在嗜水气单胞菌中的报道很少，因此，亟待加强嗜水气单胞菌外排泵RND耐药机制研究，有效解决因嗜水气单胞菌耐药造成的水产养殖病害问题。【前人研究进展】目前，已从嗜水气单胞菌标准菌株ATCC796的全基因组中检测到10个RND系统（Seshadri et al.，2006;Takahashi et al.，2014），其中7个属于疏水/两亲外排-1家族系统（Saier and Paulsen，2001;Seshadri et al.，2006）。AheB是嗜水气单胞菌中与大肠杆菌AcrB系统最密切相关的外排泵，且与铜绿假单胞菌（Pseudomas aeruginosa）中mexB的作用性质相似（Evans and Poole，1999;Hernould et al.，2008;Kiratisin et al.，2012;Sader et al.，2017）。与其他外排泵相比，AheABC关键基因表达量的变化对耐药菌的敏感性影响更明显（Morita et al.，2001;Hernould et al.，2008），且该外排泵具有底物特异性。Hernould等（2008）发现的嗜水气单胞菌AheABC外排泵是人类首次发现的气单胞菌属细菌存在外排泵多重耐药系统，其至少能泵出13种物质，包括9种抗生素;同时通过苯丙氨酸—精氨酸-β-萘酰胺（PAβN）抑制试验证实，除AheABC外排系统外还有其他的RND家族药物外排系统参与嗜水气单胞菌的自身耐药过程。因此，以恩诺沙星作为模式药物对病原菌RND系统进行研究，对揭示嗜水气单胞菌对氟喹诺酮类药物的耐药机制具有重要意义。【本研究切入点】连翘具有抗菌、抗病毒和抗氧化等作用，且成分复杂、作用靶位多、毒副作用小、不易产生耐药性，主要有效成分为苯乙醇苷类、木脂素类、挥发油类和三萜类（曲欢欢，2008;孟祥乐等，2010），其中苯乙醇苷类主要包括连翘苷和连翘脂苷，二者的作用效果迥异，即使同一有效成分对不同菌株耐药性的抑制作用也有所差别，但至今鲜见有关连翘有效成分对菌株耐药性影响的研究报道。【拟解决的关键问题】通过探究连翘3种有效成分（连翘苷、连翘脂苷A和连翘脂苷B）抑制嗜水气单胞菌耐药菌株的效果，并采用实时荧光定量PCR检测连翘对药物主动外排系统中RND相关基因表达的影响，为明确连翘延缓氟喹诺酮类药物耐药性的有效成分及揭示其延缓机制提供参考依据。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

对国家水生动物病原库保存的嗜水气单胞菌标准菌株（ATCC7966）进行诱导以获得耐药菌株;连翘苷、连翘酯苷A和连翘酯苷B（纯度≥98%）购自南京泽朗医药科技有限公司;TRIzol Reagent（15596-026）购自美国Invitrogen公司;氯仿（批号10006818）、异丙醇（批号40064360）购自国药集团化学试剂有限公司;反转录试剂盒（RRO47A）购自TaKaRa公司。主要仪器设备有制冰机（XUEKE，IMS-100）、荧光定量仪（Roche，480II Real Time PCR System）、PCR仪（BioRad，C1000）、核酸定量仪（Thermo，NanoDrop 2000c）和离心机（Eppendrof，5810R）等。

1. 2 连翘有效成分溶液配制

精确称取18.0 mg连翘苷、连翘酯苷A和连翘酯苷B粉末（纯度≥98%），充分溶解于900.0 μL二甲基亚砜（DMSO）中，配制成20 mg/mL的溶液，用0.22 μm微孔滤膜过滤5次后4 ℃保存备用。使用前以MH液体培养基稀释成200 μg/mL，确保DMSO浓度低于1%（黄智生，2016）。

1. 3 连翘及其与恩诺沙星联合作用最小抑菌浓度（MIC）测定

参考董亚萍等（2016）的方法提取连翘有效成分，再以MH液体培养基分别稀释连翘提取物（1.0 g/L）和恩诺沙星（1280 μg/mL），配制成9个浓度梯度连翘提取液（200.00、100.00、50.00、25.00、12.50、6.25、3.12、1.56和0.78 μg/mL），每个浓度梯度中的恩诺沙星浓度均为64 μg/mL;以只含64 μg/mL恩诺沙星的培养基为对照。活化的嗜水气单胞菌耐药菌株用灭菌生理盐水稀释制成0.5麦氏单位的菌悬液，取2.0 μL菌悬液加入到96孔板中，且每孔添加200.0 μL药液，每个浓度梯度设3个重复，28 ℃培养20 h后观察并记录结果，以肉眼观察培养基中无浑浊液所对应的连翘提取液浓度即为MIC。

1. 4 嗜水气单胞菌生长曲线测定

根据连翘提取物对嗜水气单胞菌耐药菌株的MIC，取一定量的连翘提取物（1.0 g/mL）置于3只无菌锥形瓶中，以含64 μg/mL恩诺沙星的MH液体培养基补足至100.0 mL，分别制成含连翘提取物1/2MIC、MIC和2MIC的MH液体培养基;另取2只无菌锥形瓶，其中，只含64 μg/mL恩诺沙星MH液体培养基的无菌锥形瓶为阴性对照，不加任何药物、只含MH液体培养基的无菌锥形瓶为阳性对照。5只锥形瓶均接种嗜水气单胞菌耐药菌株的对数菌悬液，28 ℃下摇床（180 r/min）培养，每隔1 h取适量菌液在600 nm下测定吸光值，然后以取菌液培养时间为横坐标、对应的吸光值为纵坐标，绘制耐药菌株的生长曲线。

1. 5 不同连翘有效成分对耐药菌的延缓效果

连翘的3种有效成分溶液用MH培养基分别稀释为0.05、0.10、0.25、0.50和1.00 μg/mL 5个浓度梯度，将6株嗜水气单胞菌耐药菌株分别接种到不同浓度梯度中，同时设不含连翘有效成分的MH培养基为对照。28 ℃下摇床（200 r/min）培养24 h后肉眼观察结果，当最低浓度的试管无细菌生长即为受试菌株对恩诺沙星的MIC，通过与原始MIC对比以判断其延缓耐药效果。

1. 6 菌株耐药相关基因定量分析

1. 6. 1 引物设计与合成 选择aheA、aheB和aheC 3个基因，根据基因位置在NCBI数据库（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST）下载相关序列，然后采用Primer Premier 5.0设计扩增引物（表1）。所有引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1. 6. 2 菌液總RNA提取 取2.0 mL摇床培养16～20 h的菌悬液，4 ℃下12000 r/min离心10 min，弃上清液，PBS洗脱2次，4 ℃下12000 r/min离心2 min。采用TRIzol Reagent提取菌液总RNA，并测定RNA浓度和质量。5×g DNA Eraser Buffer 2.0 μL，gDNA Eraser 1.0 μL，RNA 1 μg，RNase Free dH2O补足至10.0 μL，充分混匀，42 ℃下反应2 min以去除基因组DNA。

1. 6. 3 反转录反应 反应体系20.0 μL：RNA模板10.0 μL，Primer Script RT Enzyme MIX 1.0 μL，RT Primer MIX 1.0 μL，5×Prime Script Buffer 4.0 μL，RNase Free dH2O 4.0 μL。反转录程序：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。

1. 6. 4 实时荧光定量PCR检测 以β-action基因为内参基因，进行实时荧光定量PCR检测，每组3个重复。反应体系20.0 μL：2×SYBR Green Supermix 10.0 μL，Primer-F 1.0 μL，Primer-R 1.0 μL，cDNA模板2.0 μL，RNase-Free H2O 6.0 μL。扩增程序：95 ℃预变性5 min;95 ℃ 15 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 15 s，进行40个循环。采用2-ΔΔCt法计算目的基因的相对表达量，以GraphPad Prism 5.0制图，并采用SPSS 22.0对试验数据进行单因素方差分析（One-way ANOVA）。

1. 6. 5 连翘酯苷A对嗜水气单胞菌耐药菌株的作用 选择连翘酯苷A的高、中、低3个浓度即0.05、0.50和1.00 μg/mL作用于嗜水气单胞菌耐药菌株，然后对aheA、aheB和aheC 3个基因进行实时荧光定量PCR检测。

2 结果与分析

2. 1 连翘与恩诺沙星联合作用对嗜水气单胞菌耐药菌株的MIC

不同浓度连翘提取液与64 μg/mL恩诺沙星联合作用，随连翘提取液浓度的升高，嗜水气单胞菌耐药菌株对联合药物的敏感性增强。由表2可知，连翘提取液与恩诺沙星联合作用下，连翘提取液对嗜水气单胞菌耐药菌株的MIC为3.12 μg/mL;连翘提取液浓度为1.56 μg/mL时，嗜水气单胞菌耐药菌株对恩诺沙星的敏感度呈中介。

2. 2 连翘与恩诺沙星联合作用对嗜水气单胞菌耐药菌株生长曲线的影响

嗜水气单胞菌耐药菌株在阳性对照组中，从第1 h开始生长，至第2 h呈现出明显的生长趋势，其生长过程可分为迟缓期、对数期和稳定期。在阴性对照中，嗜水气单胞菌耐药菌株具有3个明显的生长特征期，在前4 h生长不明显，但从第4 h开始迅速生长，且生长速度与阳性对照组相近，说明该耐药菌株对64 μg/mL恩诺沙星已产生耐药性。在64 μg/mL恩诺沙星与1/2MIC连翘提取液的共同作用下，嗜水气单胞菌耐药菌株的生长明显受到抑制，在前7 h无明显生长，之后进入正常生长状态，即1/2MIC条件下恩诺沙星与连翘联合作用并未完全抑制耐药菌株生长。在MIC和2MIC的条件下，连翘提取液与恩诺沙星联合使用能有效抑制嗜水气单胞菌耐药菌株生长，24 h内未见明显的生长趋势（图1）。

2. 3 不同连翘有效成分的抑菌效果

由表3可知，连翘的3种有效成分对嗜水气单胞菌耐药菌株均表现出抑制作用，其中，连翘苷和连翘脂苷B的抑制效果均随其浓度的升高而逐渐增强，连翘脂苷A在0.25 μg/mL下即对嗜水气单胞菌耐药菌株生产明显的抑制作用，但浓度继续升高其抑制效果略有下降。在1.00 μg/mL浓度条件下，连翘脂苷A的整体抑制效果较连翘苷和连翘脂苷B的效果更好。

2. 4 连翘酯苷A作用前后耐药相关基因表达量的变化

以1.00 μg/mL连翘脂苷A作用嗜水气单胞菌耐药菌株后，通过实时荧光定量PCR测定与RND相关基因（aheA、aheB和aheC）的表达情况，结果发现3个目的基因均呈不同程度的下调表达，且以aheA基因的变化最明显（图2），呈显著下降趋势（P<0.05，下同）。由图3可看出，经0.05、0.50和1.00 μg/mL连翘脂苷A作用后，aheA基因的相对表达量均呈不同程度的下调趋势，0.05和0.50 μg/mL浓度条件下aheA基因表达差异不显著（P>0.05），而在1.00 μg/mL浓度条件下，aheA基因的相对表达量较连翘脂苷A作用前显著下降。

3 讨论

中药不仅具有明显的抗菌作用，还能延缓或抑制细菌耐药性的产生（胡梅等，2016）。王习达等（2011）研究表明，恩诺沙星与中药蒲甘散联合作用的抑菌效果明显高于单一使用恩诺沙星，且以1∶6的配比效果最佳，对异育银鲫败血症的治愈率最高。卢静等（2013）对6种中药和喹诺酮类药物单体及两两联合使用抑制嗜水气单胞菌和温和气单胞菌的效果进行对比，结果显示抑菌效果排序为联合配比>喹诺酮类单体>中草药单体。胡梅等（2016）研究表明，淫羊藿水提取物与头孢类抗菌药联用是通过协同或相加作用而提高抗菌药对产ESBLs大肠杆菌的抑制效果，但不宜与磺胺类和喹诺酮类联合用药。本研究将不同浓度的连翘提取液与64 μg/mL恩诺沙星联合作用于嗜水气单胞菌耐药菌株，并检测24 h内耐药菌株的生长趋势，结果显示在MIC和2MIC条件下，连翘提取液与恩诺沙星联合作用能有效抑制嗜水气单胞菌耐药菌株生长，24 h内未见明显的生长趋势，与朱健铭等（2017）的研究结果相似。进一步证实连翘具有延缓嗜水气单胞菌耐药性的作用，且与适宜浓度的恩诺沙星联合作用其效果更明显。

细菌在逆境胁迫下，其表面会形成一种生物被膜以抵御外界环境，如抗生素在抑制细菌生长的同时会诱导部分细菌形成生物膜。Qu等（2008）研究表明，黄连素等提取物可有效抑制耐药菌生物膜形成;官妍等（2010）研究表明，黄芩对葡萄球菌生物膜的形成无抑制作用，而连翘苷可有效抑制葡萄球菌表皮生物膜形成，且随连翘苷浓度的增加其抑制作用逐渐增强;张颖娟等（2014）通过测定连翘有效成分对大肠杆菌、肺炎链球菌和金黄色葡萄球菌等3种致病菌的抑菌效果，结果发现，连翘苷对这3种致病菌无抑菌活性，而连翘酯苷A的抑菌效果排序为大肠杆菌>金黄色葡萄球菌>肺炎链球菌。本研究结果显示，连翘的3种有效成分对嗜水气单胞菌耐药菌株均有不同程度的抑制作用，与孟祥乐等（2015）、Yan等（2017）的研究结果相似。相对于连翘的其他两种有效成分（连翘苷和连翘脂苷B），连翘酯苷A的抑菌作用和延缓耐药性效果更明显。但钟海琴（2013）在研究连翘苷、连翘脂苷A和连翘酯苷B对肺炎克雷伯氏菌外排泵的影响时，发现连翘脂苷B对肺炎克雷伯氏菌耐药菌株的抑制作用最强，可能是由于连翘的作用靶位较多，且对不同致病菌的作用机制不同，即要求进一步探究连翘对耐药菌的抑制机制。

中药对细菌及其耐药性抑制的作用机制较复杂，主要是通过抑制细菌生物被膜的形成而延缓细菌对抗菌药的耐药性（官妍等，2010;黄干荣等，2013）。任玲玲和关立增（2008）通过对比连翘作用大肠杆菌耐药菌株前后的基因组DNA，结果发现连翘可改变与药物外排作用相關的基因。AcrABC外排系统是大肠杆菌的主要多重耐药机制，而嗜水气单胞菌aheB基因与大肠杆菌主要外排系统的acrB基因功能极其相似。本研究结果表明，以1.00 μg/mL连翘脂苷A作用嗜水气单胞菌耐药菌株后，aheA、aheB和aheC基因均呈不同程度的下调表达，且以aheA基因的变化最明显;此外，经0.05、0.50和1.00 μg/mL连翘脂苷A作用后，aheA基因相对表达量也呈不同程度的下调趋势，其中在1.00 μg/mL浓度条件下，aheA基因的相对表达量较连翘脂苷A作用前显著下降。连翘酯苷A延缓嗜水气单胞菌对恩诺沙星耐药性的同时，一定程度上降低了与RND外排作用相关基因的表达，其作用机制是否与其他机制相关尚需进一步探讨。

4 结论

连翘提取液与适宜浓度的恩诺沙星联合使用对嗜水气单胞菌有明显抑制效果，同时能延缓嗜水气单胞菌的耐药性，其中又以连翘脂苷A对RND主动外排系统的抑制作用最明显。

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（責任编辑 兰宗宝）