凡纳滨对虾WDS基因克隆及其表达分析

吴诚旭 章双 黎铭 张海涛 史黎黎

摘要：【目的】分析WDS基因在凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）各组织中的表达情况及应对不同病原感染时的表达变化，以揭示WDS在动物体除生殖外其他生理活动中的功能作用。【方法】采用RACE-PCR克隆凡纳滨对虾WDS基因（LvWDS）cDNA序列，利用在线生物信息学软件进行序列分析，并以实时荧光定量PCR分析LvWDS基因在凡纳滨对虾不同组织中的表达情况及不同病原感染后的表达变化。【结果】LvWDS基因（GenBank登录号MH330316）cDNA序列全长1880 bp，其中，开放阅读框（ORF）978 bp，5'端非编码区（5'UTR）183 bp，3'端非编码区（3'UTR）719 bp，编码325个氨基酸。LvWDS氨基酸序列含有7个WD40重复序列（保守结构域），与拟穴青蟹（Scylla paramamosain）WDS氨基酸序列的相似性最高，为99%，基于WDS氨基酸序列相似性构建的系统发育进化树也显示LvWDS与拟穴青蟹WDS的亲缘关系最近。LvWDS基因在凡纳滨对虾精囊中的相对表达量最高，在血细胞、鳃和肠道等免疫组织中处于较高表达水平，在肌肉组织中的表达水平最低。经白斑综合症病毒（WSSV）和副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）感染后，凡纳滨对虾血细胞、鳃和腸道组织中LvWDS基因的相对表达量均不同程度发生变化。【结论】WDS进化十分保守，其在不同物种中的功能稳定。LvWDS除了在凡纳滨对虾生殖发育中发挥重要作用外，可能还与免疫相关，在凡纳滨对虾抗病免疫中发挥作用。

关键词： 凡纳滨对虾;WD重复蛋白;WDS基因;组织表达;白斑综合症病毒（WSSV）;副溶血弧菌

中图分类号： S945.49                           文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2019）01-0165-08

0 引言

【研究意义】我国是世界对虾养殖第一大国，凡纳滨对虾是最主要的养殖品种（农业部渔业渔政管理局，2016），而病害是制约对虾养殖产业健康发展的瓶颈（周井娟，2016）。在对虾病害中，以白斑综合症（White spot syndrome，WSS）的危害最严重（曹煜成等，2018），弧菌病则是对虾养殖过程中难以回避的问题（Lightner et al.，2005;吕莉等，2018;明磊等，2018）。对虾发病受自身因素、病原侵入及外部环境3个方面的影响，其中增强对虾自身免疫力能从根本上起到防治病害的作用（Thitamadee et al.，2016）。因此，开展对虾先天性免疫防御机制研究，对寻求有效的对虾病害防治方法具有重要意义。【前人研究进展】对虾的先天性免疫系统可分为细胞免疫和体液免疫，其中体液免疫的主体是血淋巴中一些天然或诱导产生的生物活性物质（Xu et al.，2014），主要包括各种酶类（酚氧化酶、溶菌酶、过氧化氢酶等）、免疫因子（凝集素、抗菌肽等）和调节因子等（Lai et al.，2005;Burge et al.，2007;Zhao et al.，2009;Zanjani et al.，2018），并通过Toll、IMD及JAK/STAT信号通路等多种免疫途径传递信号，最终在应对病原感染过程中发挥重要作用（Li and Xiang，2013）。但总体而言，有关对虾先天性免疫的认识还有待进一步探究。WD重复蛋白是真核生物中的一个蛋白大家族，由多种结构类似、功能各异的蛋白组成，在细胞信号转导、蛋白运输、细胞骨架装配、染色体修饰及转录调节等方面发挥重要作用（Villanueva et al.，2016），其基因突变与Allgrove综合症、Cockayne综合症等多种人类疾病相关（Li and Roberts，2001）。WD重复蛋白是由4～8个高度保守的WD重复基元（也称WD40重复）组成，WD40重复的N端一般含有一个甘氨酸—组氨酸（GH）二肽序列，C端则含有一个色氨酸—天冬氨酸（WD）二肽序列（Coronin，2008）。WDS是WD重复蛋白家族的新成员，因包含7个WD重复又名WD seven，最早从黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）饱和诱变体的致死互补群zw8中分离获得（Hollmann et al.，2002），后续的相关研究也主要集中在昆虫类动物，至今尚无脊椎动物WDS基因的相关报道。在果蝇卵子发生过程中，WDS基因的缺失会导致细胞死亡（Hollmann et al.，2002）;在柞蚕（Antherea pernyi）中，WDS基因在脂肪体和马氏管中的表达量最高，且卵巢中的表达量高于精巢，与在家蚕（Bombyx mori）中的表达规律一致（Li et al.，2011）;在甲壳类动物拟穴青蟹（Scylla paramamosain）中，WDS基因在各组织中均有表达，但以在卵巢中的表达量较高（高洁，2013）。【本研究切入点】综上所述，WDS在动物体的生殖发育过程尤其是卵子发生过程中可能发挥重要作用，但至今有关凡纳滨对虾WDS基因的功能研究鲜见报道。【拟解决的关键问题】在克隆凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）WDS基因（LvWDS）的基础上，进一步分析其在凡纳滨对虾各组织中的表达情况及应对不同病原感染时的表达变化，旨在揭示WDS在动物体除生殖外其他生理活动的功能作用。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

凡纳滨对虾（8～10 g/尾）购于广东恒兴集团有限公司，试验前暂养7 d以适应实验室环境。携带白斑综合症病毒（WSSV）的凡纳滨对虾及副溶血弧菌（Vibrio parahemolyticus）由农业农村部华南水产与畜禽饲料重点实验室保存提供;RACE模板制备试剂盒购自美国Clontech公司;RNA提取试剂盒和克隆片段胶回收试剂盒购自广州东盛生物科技有限公司;cDNA逆转录试剂盒和实时荧光定量PCR（qPCR）检测试剂盒购自日本TaKaRa公司。

1. 2 LvWDS基因cDNA克隆及序列分析

LvWDS基因的部分序列信息来源于凡纳滨对虾转录组数据，同时采用Primer Premer 5.0设计5'RACE和3'RACE特异性引物（表1），5'端和3'端RACE-PCR扩增分别采用特异性引物WDS-5R和WDS-3R与通用引物NUP配对，具体反应体系和扩增程序参照黄金凤等（2017）的研究方法。RACE-PCR扩增产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳检测后，回收目的片段进行测序鉴定。

1. 3 LvWDS基因序列生物信息学分析

利用NCBI网站中的BLAST、EditSeq及SMART等在线软件对LvWDS基因序列进行比对分析，预测其开放阅读框（ORF）及氨基酸序列，并分析其编码蛋白功能结构域等相关生物学信息。利用ClustalX对不同物种来源的WDS蛋白序列进行多序列比对，并以MEGA 7.0构建系统发育进化树。

1. 4 LvWDS基因在凡纳滨对虾组织中的表达差异分析

随机挑选暂养7 d后的凡纳滨对虾12尾，4尾一组，分别采集眼柄、肝胰腺、胃、表皮、心脏、血细胞、神经、肌肉、精囊、鳃和肠道等11个组织提取总RNA，反转录合成cDNA 模板后用于qPCR定量分析，引物为WDS-qF和WDS-qR，具体操作参照黄金凤等（2017）的方法。以EF1α基因为内参基因。

1. 5 WSSV和副溶血弧菌感染后LvWDS基因表达差異分析

将凡纳滨对虾分为3组，每组90尾，每组又分成3个平行（10尾）。WSSV悬液制备、副溶血弧菌培养鉴定及人工感染均参照Zhang等（2016）的方法，分别在注射感染后不同时间点（0、4、8、12、24、48和72 h）采集血细胞、肠道和鳃3种组织，每个平行取3尾对虾的相同组织混合成1个样品。qPCR定量分析同1.4，并采用 t 检验进行LvWDS基因表达差异分析。

2 结果与分析

2. 1 LvWDS基因cDNA全长及其序列分析结果

将RACE-PCR扩增产物拼接即获得LvWDS基因（GenBank登录号MH330316），测序结果（图1）表明，其cDNA全长1880 bp，包括ORF 978 bp、5'端非编码区（5'UTR）183 bp和3'端非编码区（3'UTR）719 bp，编码325个氨基酸。SMART分析结果显示，LvWDS氨基酸序列含有7个WD40保守结构域（图2），分别位于第25～64、67～106、109～148、151～190、193～233、236～278和281～322位氨基酸残基。通过对比LvWDS氨基酸序列中的7个WD40重复序列（保守结构域），发现与其他6个WD40重复序列不同，第7个WD40重复序列在靠近C端有两个氨基酸残基插入（图3）。

2. 2 LvWDS氨基酸多重序列比对分析结果

分析不同物种WDS氨基酸序列间的相似性，结果显示，LvWDS与所选昆虫类和甲壳动物类中多个物种WDS氨基酸序列的相似性较高，均超过84%，其中，与拟穴青蟹WDS氨基酸序列的相似性最高，达99%（图4）。基于WDS氨基酸序列相似性构建的系统发育进化树（图5）也显示，LvWDS与同为甲壳动物的拟穴青蟹WDS和大型溞WDS聚为一类，且与拟穴青蟹的亲缘关系最近。

2. 3 LvWDS基因在凡纳滨对虾不同组织中的表达情况

LvWDS基因在凡纳滨对虾不同组织中的表达情况如图6所示。LvWDS基因在11种组织中均被检测到，其中以心脏、血细胞、神经、精囊、鳃及肠道组织中的表达量较高，而在肌肉组织中的表达量最低。经2−△△Ct换算得知，LvWDS基因在精囊中的相对表达量最高，约是肌肉中相对表达量的22.40倍，在鳃组织中的表达量次之（图7）。

2. 4 WSSV感染对LvWDS基因表达的影响

WSSV感染后，凡纳滨对虾血细胞中LvWDS基因的相对表达量呈先升高后降低的变化趋势（图8-A），在感染后24 h达峰值，约是对照组的3.00倍;感染48 h后开始下降，与对照组无显著差异（P>0.05，下同）。WSSV感染后8 h内，凡纳滨对虾鳃组织中LvWDS基因的表达水平与对照组无显著差异;至感染后12 h，LvWDS基因的表达水平较对照组显著升高（P<0.05，下同）;至感染后24 h达最高值，约是对照组的3.00倍;感染72 h后又降至对照组水平，二者差异不显著（图8-B）。在肠道组织中，LvWDS基因的相对表达量在凡纳滨对虾感染WSSV后呈先下降后上升再下降的变化趋势;感染4 h后，其相对表达量较对照组显著下降，约是对照组的60%;感染8 h后开始升高，且各检测时间点均显著或极显著（P<0.01，下同）高于对照组，至感染后24 h达最高值，约是对照组的3.50倍（图8-C）。

2. 5 副溶血弧菌感染对LvWDS基因表达的影响

注射感染副溶血弧菌后，凡纳滨对虾血细胞中LvWDS基因的相对表达量除了感染后12和72 h外，其他检测时间点均显著或极显著高于对照组，以感染后8 h的相对表达量最高，约是对照组的2.10倍（图9-A）。感染副溶血弧菌后12 h内，凡纳滨对虾鳃组织中LvWDS基因的相对表达量显著或极显著低于对照组，但感染24 h后较对照组极显著升高，至感染后48 h又降至与对照组无显著差异的表达水平（图9-B）。在肠道组织中，LvWDS基因的相对表达量在各检测时间点均显著或极显著高于对照组，以感染后4 h的相对表达量最高，约是对照组的3.30倍（图9-C）。

3 讨论

WDS作为新发现的WD重复蛋白家族成员，主要认为其与动植物的生殖发育相关。本研究成功从凡纳滨对虾克隆获得LvWDS基因，其蛋白序列分析发现，LvWDS具有WDS蛋白的典型特征，包含7个WD40重复序列，与其他物种的同源蛋白一致。目前，在NCBI中能搜索到已注册且具有ORF全长的WDS基因序列主要有无脊椎动物、植物和真菌三大类，脊椎动物中只能搜索到相关的表达序列标签（EST）信息。对不同物种间的WDS蛋白氨基酸序列进行多重比对分析，结果发现各物种间相同位置WD重复基元的氨基酸序列十分保守，同源性较高;在WDS氨基酸序列的最后一个WD40重复序列中，除致倦库蚊的插入氨基酸为谷氨酸（E）和丝氨酸（S）外，包括黑腹果蝇（Hollmann et al.，2002）和柞蚕（Li et al.，2011）在内的多个物种插入氨基酸均为谷氨酸（E）和天冬酰胺（N），LvWDS氨基酸序列中的插入序列也为E和N。LvWDS与不同物种WDS蛋白的相似性较高，其中与同为甲壳动物拟穴青蟹WDS的相似性高达99%;基于WDS氨基酸序列相似性构建的系统发育进化树也显示，LvWDS与拟穴青蟹WDS的亲缘关系最近。可见，WDS在进化上十分保守，暗示其在不同物种中的功能稳定。

目前，有关WDS基因在动物体不同组织分布的信息不多，仅在果蝇、柞蚕和拟穴青蟹中有相关报道，其中在柞蚕（Li et al.，2011）和拟穴青蟹（高洁，2013）中WDS基因的组织分布信息相对全面。与果蝇、柞蚕和拟穴青蟹WDS基因在生殖相关的组织中表达量最高相一致，LvWDS基因在凡纳滨对虾精囊中的相对表达量最高，提示LvWDS在凡纳滨对虾生殖发育中发挥重要作用。在拟穴青蟹中，除生殖相关组织外，WDS基因在鳃、血细胞和肠道等免疫组织中的表达量较高，而在肝胰腺中的表达量最低（高洁，2013）。同样，LvWDS基因在凡纳滨对虾的鳃、血细胞和肠道组织中表达量较高，其中在鳃组织中的表达量仅次于精囊，提示LvWDS基因很可能与凡纳滨对虾的免疫相关。与前人的相关研究（Li et al.，2011;高洁，2013）不同，本研究中LvWDS基因在凡纳滨对虾肌肉组织中表达量最低，而在柞蚕和拟穴青蟹肌肉组织中的表达量均处于较高水平，说明在不同物种中WDS基因功能呈多样性。

在人类生命的信号转导和疾病防御及其治疗上，WD重复蛋白调控机制发挥着不可或缺的作用（Coronin，2008）。WD重复蛋白之一smu-1在罗氏沼虾中被干扰后，罗氏沼虾应对热诱导能力显著降低（钱美睿，2013）。同为WD重复家族成员，WDS在动物体中的研究主要集中在生殖功能方面（Hollmann et al.，2002;Li et al.，2011;高潔，2013;Ye et al.，2014）。考虑到WD重复蛋白家族基因功能的多样性，基于LvWDS基因在凡纳滨对虾免疫组织中的较高表达情况，本研究对凡纳滨对虾应答病原感染时LvWDS基因的表达情况进行分析，结果显示，病毒（WSSV）和细菌（副溶血弧菌）感染均能不同程度刺激对虾体内血细胞、鳃和肠道等免疫组织中LvWDS基因的表达，一定程度上表明LvWDS参与凡纳滨对虾的抗病免疫，但其参与免疫的具体作用途径有待进一步探究验证。

4 结论

WDS进化十分保守，其在不同物种中的功能稳定。LvWDS除了在凡纳滨对虾生殖发育中发挥重要作用外，可能还与免疫相关，在凡纳滨对虾抗病免疫中发挥作用。

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（責任编辑 兰宗宝）