鸭胚成纤维细胞上坦布苏病毒受体蛋白的鉴定

赵冬敏 韩凯凯 刘青涛 黄欣梅 杨婧 刘宇卓

摘要：【目的】拓展对坦布苏病毒受体的认知，为研究其在鸭体内的感染机制打下基础。【方法】取9日龄SPF鸭胚制备鸭胚成纤维细胞（DEF），待细胞长成单层后提取DEF膜蛋白，利用免疫共沉淀试验筛选出DEF膜蛋白中可与坦布苏病毒结合的蛋白，经病毒辅覆蛋白结合分析（VOPBA）验证后通过LC-MSMS质谱分析进行鉴定;同时人工合成鸭热休克蛋白70基因（HSP70）序列的开放阅读框（1905 bp），构建重组质粒pET32a-HSP70并转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞，经IPTG诱导表达，以重组蛋白免疫小鼠制备抗鸭HSP70血清，与DEF细胞共孵育后接种坦布苏病毒，并采用实时荧光定量PCR检测抗血清对病毒感染的抑制作用。【结果】DEF膜蛋白中分子量约70 kD的蛋白可与坦布苏病毒结合，经LC-MSMS质谱分析和序列比对可确定该蛋白即为鸭热休克蛋白70（HSP70）。含重组质粒pET32a-HSP70的BL21（DE3）感受态细胞经IPTG诱导4 h后，SDS-PAGE检测发现在分子量约85 kD处出现目的蛋白条带，获得的重组鸭HSP70蛋白主要以包涵体形式进行表达，且能与His标签抗体发生特异性反应。以重组鸭HSP70蛋白免疫小鼠获得的抗鸭HSP70血清可封闭DEF细胞上的HSP70，而竞争性抑制坦布苏病毒感染。【结论】HSP70是坦布苏病毒感染DEF细胞的受体，可作为新的靶点用于抗坦布苏病毒药物设计。

关键词： 坦布苏病毒;鸭胚成纤维细胞;热休克蛋白70;受体;免疫共沉淀;病毒辅覆蛋白结合分析（VOPBA）

中图分类号： S852.657                               文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2019）01-0173-06

0 引言

【研究意义】自2010年以来，坦布苏病毒（Tembusu virus，TMUV）在我国多个省（市）鸭、鹅养殖场引起一种以食欲急剧减退、产蛋量骤降为主要特征的新发疫病，给水禽养殖业造成重大经济损失（赵冬敏等，2014;黄欣梅等，2015）。坦布苏病毒感染率最高可达100%，死亡率5%～30%（Su et al.，2011）。除鴨和鹅外，坦布苏病毒还可自然感染鸡、鸽子和麻雀等禽类（Tang et al.，2013）。在人工攻毒条件下，坦布苏病毒可感染小鼠并表现出对神经系统的致病力（Zhang et al.，2017）。体外培养试验发现，坦布苏病毒在哺乳动物细胞系（Vero、BHK-21、Hela、HepG2和SH-SY5Y）、禽源细胞系（DEF、CEF、GEF和DF-1）和蚊细胞系（C6/36和白纹伊蚊细胞）中均表现出良好的繁殖特性（Zhang et al.，2017），说明其感染宿主谱极其广泛。因此，明确坦布苏病毒在不同动物体内的感染机制，对科学防控坦布苏病毒病具有重要意义。【前人研究进展】坦布苏病毒隶属于黄病毒科（Flaviviridae）黄病毒属（Flavivirus），该属病毒还包括登革病毒、日本脑炎病毒、西尼罗病毒、黄热病毒和寨卡病毒等虫媒病毒（赵冬敏等，2017）。黄病毒属病毒囊膜蛋白以延伸的二聚体形式平铺于病毒表面，在病毒感染细胞的过程中，囊膜蛋白作为吸附蛋白与细胞表面的受体分子结合，使病毒粒子吸附于靶细胞，随后通过内吞作用进入细胞（Smit et al.，2011）。黄病毒属病毒感染不同细胞时所使用的受体具有多样性，不同细胞型表面的不同分子均有可能成为受体。Liu等（2017）通过免疫共沉淀和病毒辅覆蛋白结合分析（VOPBA）鉴定出热休克蛋白A9是坦布苏病毒在DF-1细胞上的受体分子;Zhao等（2018）利用VOPBA分析和间接免疫荧光法证实GRP78作为受体分子参与坦布苏病毒感染BHK-21细胞。受体的分子类型依赖于细胞类型和病毒血清型，已有研究结果显示，CD14相关蛋白（Chen et al.，1999）、整合素β3（Chu and Ng，2004）、GRP78/BiP （Jindadamrongwech et al.，2004）、高亲和性层粘连蛋白（Thepparit and Smith，2004）、热休克蛋白90/70（Reyes-Del Valle et al.，2005）、DC-SIGN（Pokidysheva et al.，2006）、硫酸乙酰肝素（Pattnaik et al.，2007）、凝集素（Chen et al.，2008）和微管蛋白的β链（Fang et al.，2013）等均可作为黄病毒属病毒感染不同细胞时的受体，而这些受体正是研发抗黄病毒属病毒药物的潜在靶点。【本研究切入点】坦布苏病毒感染宿主谱十分广泛，但针对其受体的研究较少，且至今尚无坦布苏病毒感染鸭胚成纤维细胞（DEF）受体鉴定的相关报道。【拟解决的关键问题】利用免疫共沉淀试验分离DEF细胞膜中能与坦布苏病毒结合的受体蛋白，经VOPBA验证后通过LC-MSMS质谱分析进行鉴定，旨在拓展对坦布苏病毒受体的认知，为研究其在鸭体内的感染机制打下基础。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

坦布苏病毒JS804株和坦布苏病毒囊膜蛋白特异性单克隆抗体均由江苏省农业科学院兽医研究所禽病与生物兽药研究室保存提供;9日龄SPF鸭胚购自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所;细胞膜蛋白提取试剂盒购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司;Protein A+G琼脂糖、His标签抗体和碱性磷酸酶标记的羊抗鼠IgG均购自上海碧云天生物技术有限公司。

1. 2 DEF细胞制备

取9日龄SPF鸭胚置于蛋托上，以75%酒精棉球擦拭蛋壳，随后在气室部位将蛋壳击碎，用无菌剪刀将卵膜剪开，取出鸭胚，去除鸭胚四肢、眼、喙、内脏及脑组织。以PBS洗涤鸭胚后放入小烧杯中剪碎，PBS洗涤剪碎的鸭胚，静置5 min，弃上清液;加入1.0 mL胰酶37 ℃消化10 min，再加入10.0 mL含5%胎牛血清的DMEM终止反应，用吸管吹打数次后进行细胞计数。计数后吸取上清液分装于细胞瓶中，每瓶约5×106个细胞。

1. 3 DEF膜蛋白提取

以胰酶消化长成单层的DEF细胞，用含5%胎牛血清的DMEM终止反应，2000 r/min离心5 min，收集细胞，根据细胞膜蛋白提取试剂盒说明提取DEF膜蛋白。提取的DEF膜蛋白分装后-80 ℃保存备用。

1. 4 免疫共沉淀试验

（1）去除非特异性结合：取400.0 μL提取的DEF膜蛋白，加入10.0 μL阴性小鼠血清和20.0 μL Protein A+G琼脂糖，4 ℃摇床（缓慢摇动，下同）孵育2 h;3500 r/min离心5 min，取上清液用于后续试验。（2）免疫共沉淀：于上述上清液中加入400.0 μL纯化的坦布苏病毒，4 ℃摇床孵育5 h，再加入10.0 μL坦布苏病毒囊膜蛋白特异性单克隆抗体，4 ℃摇床孵育过夜;加入20.0 μL充分重悬的 Protein A+G琼脂糖，4 ℃摇床孵育3 h。3500 r/min离心5 min，小心弃除上清液，沉淀用PBS洗涤5次，加入40.0 μL 4×SDS-PAGE电泳上样缓冲液重悬沉淀，沸水处理5 min后进行SDS-PAGE检测。对照组不加坦布苏病毒，其余操作相同。电泳结束后进行考马斯亮蓝染色，并将筛选获得的蛋白条带切下送至上海博苑生物科技有限公司进行LC-MSMS质谱分析。

1. 5 VOPBA分析

对提取的DEF膜蛋白进行SDS-PAGE电泳并转印至NC膜上，利用3%牛血清白蛋白封闭后，加入纯化坦布苏病毒，4 ℃孵育过夜。NC膜以PBST洗涤3次，加入坦布苏病毒囊膜蛋白特异性单克隆抗体，37 ℃孵育1 h后用PBST洗涤3次，加入碱性磷酸酶标记的羊抗鼠IgG，37 ℃再孵育1 h。孵育结束后，以PBST洗涤3次，利用碱性磷酸酶显色试剂盒进行显色反应。对照组不加入坦布苏病毒，其余操作相同。

1. 6 鸭热休克蛋白70（HSP70）原核表达及鉴定

根据蛋白质谱分析结果和GenBank已公布的鸭HSP70基因序列（EU678246.2），人工合成鸭HSP70基因序列的开放阅读框（1905 bp），并分别在5'和3'端加入Sal I（GTCGAC）和Not I（GCGGCCGC）酶切位点。在合成鸭HSP70基因片段的Sal I和Not I位点插入pET32a原核表达载体，转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞，过夜培养后选取酶切鑒定呈阳性的重组质粒送至南京金斯瑞生物科技有限公司测序，测序正确的重组质粒命名为pET32a-HSP70。将含pET32a-HSP70的BL21（DE3）感受态细胞接种至含100 μg/mL氨苄霉素的LB液体培养基中，37 ℃振荡培养至OD600约0.4，加入终浓度为1 mmol/L的IPTG进行诱导表达。诱导4 h后收集菌液，6000 r/min离心10 min，弃上清液，沉淀用PBS重悬，超声波破碎15 min后6000 r/min离心10 min，分别取上清液和沉淀进行SDS-PAGE检测。同时将表达蛋白转印至NC膜上，用5% BSA在37 ℃下封闭2 h，PBST（含0.05% Tween-20）洗涤3次，加入抗His标签抗体，4 ℃孵育过夜;PBST洗涤3次，加入碱性磷酸酯酶标记的羊抗鼠IgG，37 ℃孵育1 h;PBST洗涤3次，加入碱性磷酸酶底物显色。

1. 7 抗鸭HSP70血清制备

将纯化的重组鸭HSP70蛋白与等量弗氏完全佐剂完全乳化后免疫6周龄雌性Balb/c小鼠，免疫剂量为70 μg/只。每隔2周加强免疫1次，共免疫3次，最后一次免疫后2周采集血清。以提取的DEF膜蛋白包被ELISA板，利用间接ELISA检测血清中抗重组鸭HSP70蛋白的抗体效价（朱文姣等，2018）。

1. 8 抗鸭HSP70血清对坦布苏病毒感染的抑制作用

接种DEF细胞于48孔板中，长成单层后与终浓度为100 μg/mL的抗鸭HSP70血清4 ℃共孵育1 h。对照组DEF细胞与空白小鼠的阴性血清进行共孵育，其余操作相同。弃孵育上清液，以冰预冷的PBS洗涤2次，接种坦布苏病毒，4 ℃孵育30 min后再37 ℃孵育1 h。弃上清液，以冰预冷的PBS洗涤2次，加入含10%胎牛血清的1640培养液，37 ℃孵育24 h。收集细胞，利用QIAamp Viral RNA Mini Kit（Qiagen）试剂盒提取RNA，按照HiScript II Q select RT SuperMix for qPCR（诺唯赞）说明进行反转录。以合成的cDNA为模板，采用实时荧光定量PCR检测坦布苏病毒核酸，并以GAPDH为内参基因，采用2−△△Ct计算其相对表达量（Livak and Schmittgen，2001）。

2 结果与分析

2. 1 DEF膜蛋白与坦布苏病毒的免疫共沉淀试验结果

利用免疫共沉淀试验筛选DEF膜蛋白中可与坦布苏病毒结合的蛋白，SDS-PAGE检测结果（图1）显示，约在70 kD处出现1条目的蛋白条带，而对照组未出现对应的目的条带。将分子量约70 kD的蛋白条带切下送至上海博苑生物科技有限公司进行LC-MSMS质谱分析。

2. 2 DEF膜蛋白与坦布苏病毒结合的验证结果

为进一步验证DEF膜蛋白与坦布苏病毒的结合作用，对提取的DEF膜蛋白进行SDS-PAGE检测并转印至NC膜上，与纯化坦布苏病毒孵育后进行VOPBA分析。结果显示，在分子量约70 kD处通过坦布苏病毒囊膜蛋白特异性单克隆抗体检测到1条蛋白条带（图2），与免疫共沉淀试验结果一致;而对照组未出现对应的目的条带，故确定DEF膜蛋白中分子量约70 kD的蛋白可与坦布苏病毒结合。

2. 3 LC-MSMS质谱分析结果

为确定分子量约70 kD的蛋白是何种蛋白，将该蛋白条带切下送至上海博苑生物科技有限公司进行LC-MSMS质谱分析，并将质谱分析结果（表1）输入鸭蛋白质数据库中进行比对，发现得分最高的蛋白为鸭热休克蛋白70（HSP70）。鉴于检测到的其他几种蛋白为细胞生长、代谢和凋亡等相关蛋白，同时参考其他黄病毒属病毒的HSP70受体（Das et al.，2009），因此，可确定通过免疫共沉淀和VOPBA分析筛选获得可与坦布苏病毒结合的蛋白即为鸭HSP70。

2. 4 鸭HSP70蛋白原核表达及鉴定结果

SDS-PAGE检测结果显示，含重组质粒pET32a-HSP70的BL21（DE3）感受態细胞经IPTG诱导4 h后，可在分子量约85 kD处出现目的蛋白条带（图3）。经超声波破碎后的SDS-PAGE检测结果（图4）显示，重组鸭HSP70蛋白主要以包涵体形式进行表达。利用His标签抗体进行Western blotting鉴定，结果显示诱导后的菌液在分子量约85 kD处出现能与His标签抗体反应的特异性条带（图5）。

2. 5 抗鸭HSP70蛋白血清效价测定结果

用提取的DEF膜蛋白包被ELISA板，以重组鸭HSP70蛋白免疫小鼠血清为一抗，采用间接ELISA测定其血清效价，结果表明，免疫小鼠产生了抗鸭HSP70蛋白的抗体，抗体效价达1∶400。

2. 6 抗鸭HSP70血清对坦布苏病毒感染的竞争性抑制作用

为检验抗鸭HSP70血清是否可封闭DEF细胞上的HSP70而抑制坦布苏病毒感染，在接种坦布苏病毒前加入抗鸭HSP70血清与DEF细胞进行共孵育，对照组采用空白小鼠的阴性血清进行共孵育。实时荧光定量PCR检测结果（图6）显示，与对照组相比，抗鸭HSP70血清孵育DEF细胞中的坦布苏病毒含量显著降低（P<0.05），说明抗鸭HSP70血清可结合HSP70而封闭受体，竞争性抑制坦布苏病毒感染。

3 讨论

热休克蛋白（HSP）是从细菌到哺乳动物广泛存在的一类高度保守的热应激蛋白，按其分子量大小可分为HSP100、HSP90、HSP70、HSP60、小分子HSP和泛素，其中最主要的是HSP70家族（张杰等，2017）。HSP70在进化上高度保守，可划分为3个功能域：N端为45 kD的ATPase活性结构域，紧接着为18 kD的多肽结合域及C端功能尚不明确的10 kD结构域（任宝波等，2005）。HSP70已被鉴定为登革病毒感染单核细胞、巨噬细胞及C6/36细胞时的受体（Fang et al.，2013;张响英等，2017）。此外，Reyes-Del Valle等（2005）研究表明，HSP70和HSP90是登革病毒侵入人类神经母细胞瘤所需受体复合物的组成部分;Das等（2009）研究证实HSP70是乙型脑炎病毒感染蚊细胞和神经细胞（Neuro2A细胞）时的受体。可见，HSP70作为受体或受体复合物的一部分在黄病毒属病毒入侵宿主细胞的过程中发挥重要作用。本研究采用免疫共沉淀试验分离出坦布苏病毒感染DEF细胞的受体是分子量为70 kD的蛋白，通过LC-MSMS质谱分析确定该蛋白为HSP70，首次鉴定出坦布苏病毒在DEF细胞中的受体，为进一步研究鸭坦布苏病毒的感染和致病机制打下基础。

病毒吸附蛋白与细胞受体分子间的相互作用介导病毒进入宿主细胞，目前认为这种相互作用与病毒的宿主谱、组织嗜性和致病机制有关。病毒—受体的相互作用是一个多步骤过程，且该过程中可能依次涉及多种受体或辅助受体（Reyes-Del Valle et al.，2005）。黄病毒属病毒感染细胞所需的受体呈多样性，且依赖于细胞类型和病毒血清型，即使同一细胞也可能采用不同分子作为受体（Liu et al.，2017）。本研究结果虽然显示抗鸭HSP70血清对坦布苏病毒感染具有竞争性抑制作用，但并不能完全抑制病毒感染，说明在DEF细胞中还存在其他受体分子，具体是何种受体尚有待进一步探究。

4 结论

HSP70是坦布苏病毒感染DEF细胞的受体，可作为新的靶点用于抗坦布苏病毒药物设计。

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（責任编辑 兰宗宝）