辛硫磷对鲫鱼肝微粒体中CYP1A活性及其表达水平的影响

李思 刘晓宇

摘要：【目的】研究辛硫磷暴露對鲫鱼肝微粒体中细胞色素P4501a（CYP1A）活性及其mRNA和蛋白表达的影响，明确其剂量—效应及时间—效应关系，为揭示有机磷农药对水生生物的代谢调节机制提供理论依据。【方法】设辛硫磷低、中、高浓度组（0.0825、0.165和0.33 mg/L）和丙酮（助溶剂）对照组，采用半静态染毒法染毒鲫鱼，分别于染毒24、48、72和96 h后取样并迅速剖解取出鲫鱼肝胰脏，以CYP1A相关酶7-乙氧基-3-异吩唑酮-脱乙基酶（EROD）活性反映CYP1A活性，采用实时荧光定量PCR和Western blotting分别测定鲫鱼肝微粒体中CYP1A基因mRNA及其蛋白的表达情况。【结果】辛硫磷对鲫鱼肝微粒体中CYP1A活性产生抑制作用，辛硫磷染毒24 h时CYP1A活性与辛硫磷存在明显的剂量—效应关系;各辛硫磷浓度组间均存在明显的时间—效应关系，至染毒96 h时低、中、高浓度组鲫鱼肝微粒体中CYP1A活性分别较对照组下降54.7%、30.4%和65.5%，且差异极显著（P<0.01，下同）。辛硫磷染毒后，鲫鱼肝微粒体中CYP1A基因mRNA的表达整体上呈明显下调趋势，各染毒时间组间均存在较强的剂量—效应关系，除染毒48 h时CYP1A基因mRNA相对表达量与辛硫磷浓度呈正相关外，其他染毒时间点均呈负相关。辛硫磷对鲫鱼肝微粒体中CYP1A蛋白表达的影响均达极显著水平，且呈明显的剂量—效应及时间—效应关系，至染毒96 h时低、中、高浓度组的表达量分别较对照组降低74.6%、82.6%和85.7%。【结论】辛硫磷能抑制鲫鱼肝微粒体中CYP1A活性并下调CYP1A基因mRNA及其蛋白的表达;相对于辛硫磷产生的剂量—效应影响，其对CYP1A活性及其蛋白表达的时间—效应影响更明显。

关键词： 鲫鱼;辛硫磷;肝微粒体;细胞色素P4501a（CYP1A）;活性;表达

中图分类号： S965.117                         文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2019）10-2329-06

Effects of phoxim on the activity and expression of CYP1A in liver microsomes of Carassius auratus gibebio（crucian carp）

LI Si1， LIU Xiao-yu1，2*

（1College of Food Science and Technology， Huazhong Agricultural University， Wuhan  430070， China;

2Key Laboratory of Environment Correlative Dietology， Ministry of Education， Wuhan  430070， China）

Abstract：【Objective】The effects of phoxim on the activity， mRNA and protein expression of cytochrome P4501a（CYP1A） in crucian carp liver microsomes were investigated， and the dose-dependent and time-dependent relations were studied to provide basis for further exploring the regulatory effects and mechanisms of organophosphorus pesticide on hydrobios. 【Method】Semi-static exposure method was used in the experiment to infect crucian carp.  Low-， mid- and high-dose groups of phoxim（0.0825、0.165、0.33 mg/L） and acetone（solvent） control group，were set up. The crucian carps were sampled and dissected after 24， 48， 72 and 96 h of infection， then hepatopancreas was taken out. CYP1A activity was reflected by the activity of CYP1A-related enzyme 7-ethoxy-3-ethoxyresorufin-O-deethylase（EROD）. The mRNA and protein expression of CYP1A gene in crucian carp liver microsomes were detected by real-time fluorescence quantitative PCR and Western blotting， respectively. 【Result】Phoxim had inhibitory effect on the activity of CYP1A， it had obvious dose-dependent manner exposed to phoxim after 24 h and had obvious time-dependent manner in different concentration groups. The activities of CYP1A decreased by 54.7%， 30.4% and 65.5% in low-， mid- and high-dose groups respectively compared with the control group after 96 h and the difference was extremely significant（P<0.01， the same below）. The mRNA expression of CYP1A was significantly down-regulated in crucian carp liver microsomes after infection，and there was a obvious dose-dependent manner at different exposure times. The mRNA expression level of CYP1A was positively correlated with the phoxim concentration after 48 h but negatively correlated with concentration in other exposure times. The effects of phoxim on protein expression of CYP1A in crucian carp liver microsomes all reached extremely significant level， and presented dose-dependent and time-dependent relations. The expression levels after 96 h of exposure at low-， mid- and high-dose groups were decreased by 74.6%， 82.6% and 85.7% respectively compared with the control.【Conclusion】Phoxim can inhibit the activity of CYP1A in the liver microsomes of crucian carp and down-regulate the mRNA and protein expression of CYP1A. Compared with the dose-dependent effect， phoxim has a more obvious time-dependent manner on the activity and protein expression of CYP1A.

Key words： crucian carp; phoxim;  liver microsomes ; cytochrome P4501a（CYP1A）; activity; expression

0 引言

【研究意义】辛硫磷（Phoxim）是一种高效低毒的有机磷杀虫剂，已广泛应用于农业生产，在水产养殖中主要用于清塘和病虫害防治（王立梅等，2011;高平等，2014），但施用于田间的辛硫磷可通过地表径流进入地表水而造成水体污染（汤亚飞等，2004）。辛硫磷对哺乳动物低毒，但对鱼类呈现出高毒性，具体表现为在鱼体内产生蓄积效应、损伤组织器官或形成神经及生殖毒性影响（Zhang et al.，2010）。细胞色素P450酶（CYP450）是动物体内最重要的外源性毒性物质代谢酶（Guengerich，2006），而细胞色素P4501a（CYP1A）作为其主要的亚型酶，广泛存在于鱼类的肝微粒体中，在外源性物质的生物转化过程中发揮重要作用，毒性环境暴露可导致受体介导的CYP1A基因表达变化（Sarasquete and Segner，2000）。因此，研究辛硫磷对水生动物肝脏中CYP1A代谢调控的影响，明确鱼类CYP1A能否作为水产环境辛硫磷污染的生物标志物，可为监测渔药休药期及淡水环境安全问题提供理论依据。【前人研究进展】目前，国内外学者已开展大量有关外源性物质对水生动物CYP1A影响的研究工作。Hu等（2011）研究了恩诺沙星对鲫鱼CYP1A基因mRNA及蛋白表达的影响，结果显示恩诺沙星可通过抑制CYP1A基因mRNA及其蛋白表达而进一步抑制CYP1A的催化活性;郑榕辉等（2012）以褐菖鲉（Sebastiscus marmoratus）为研究对象，开展原油水溶性组分（WSF）对鱼肝CYP1A蛋白表达的诱导试验，以期为建立海洋石油类污染及其生化效应的鱼肝CYP1A蛋白印迹法生物标志物监测技术提供科学依据;王英英等（2013）研究表明，构建的剑尾鱼（Xiphophorus helleri）脑细胞系经10-8～10-5 mol/L苯并（a）芘诱导后，CYP1A基因mRNA表达量显著上调，且表现出良好的剂量—效应关系，即剑尾鱼脑细胞系的建立可为其毒理学研究提供技术支持;肖衎（2013）研究发现，唐鱼（Tanichthys albonubes）CYP1A对镉和铜胁迫的响应具有可测性和敏感性，可作为生物标志物用于水环境重金属污染监测与评价;Li等（2016）研究发现，水生环境污染物三丁基锡的长期暴露能提高幼年鲤鱼脑组织中CYP1A基因的转录水平及抑制7-乙氧基-3-异吩唑酮-脱乙基酶（EROD）活性。其中，有机磷农药对鱼类CYP1A的影响研究日益增多。Fu等（2013）分析了2种有机磷农药（阿特拉津和毒死蜱）对鲤鱼鳃中CYP1A基因mRNA表达水平的影响;李宏等（2016）通过建立Cocktail探针药物法分析发现辛硫磷能抑制鲫鱼体内的CYP1A活性;Altun等（2017）研究发现，毒死蜱暴露下鲤鱼脑组织中的CYP1A基因表达呈下调趋势。此外，辛硫磷与其他农药如灭多威等联用则对鱼体产生协同作用（孟顺龙等，2014;余德琴等，2015）。【本研究切入点】鲫鱼是我国重要的大宗淡水鱼类之一，位居大宗淡水鱼第四位（刘兴旺和张海涛，2012），但有关辛硫磷对鲫鱼的毒性影响研究十分有限，至今未见辛硫磷对鲫鱼肝微粒体CYP1A活性及其表达影响的研究报道。【拟解决的关键问题】研究辛硫磷暴露对鲫鱼肝微粒体中CYP1A活性及其mRNA和蛋白表达的影响，明确其剂量—效应及时间—效应关系，为揭示有机磷农药对水生生物的代谢调节机制提供理论依据。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

试验用鲫鱼购自武汉汤逊湖鲫鱼养殖场，平均体重107.0±14.2 g/尾。试验前将鲫鱼置于50 cm×30 cm×20 cm的玻璃水箱内驯养1周，养殖用水为充分曝气除氯后的自来水，增氧机连续增氧，每日换水1次并清理缸内杂物，水温控制在（25±2）℃。99%辛硫磷分析标准品购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司;动物组织/细胞总RNA提取试剂盒、第一链反转录试剂盒和SYBR qPCR Mix（荧光定量）购自北京庄盟国际生物基因科技有限公司;BCA蛋白浓度测定试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司;EROD检测试剂盒购自江苏科晶生物科技有限公司;兔抗CYP1A多克隆抗体（GTX128377）购自Gene-Tex公司，兔抗GAPDH多克隆抗体（AB-P-R 001）购自杭州贤至生物科技有限公司，HRP标记羊抗兔lgG二抗（BA1054）购自武汉博士德生物工程有限公司。主要仪器设备：超高速冷冻离心机（Optima L-90K，Beckman Coulter Inc/USA），荧光定量PCR仪（Qtower 2.2，Analytik Jena AG，German）。

1. 2 引物设计与合成

参照Zhou等（2011）的方法设计引物，并委托武汉百捷智生物科技有限公司合成。其中，鲫鱼CYP1A基因扩增引物为F1（5'-CATCCCTTTCTTGC GTATCCT-3'）和R1（5'-CGTTTGAGTTCTCGTCCA GTTT-3'），β-actin内参基因扩增引物为F2（5'-TCT TTTCCAGCCATCCTTCCTA-3'）和R2（5'-GGTCAG CAATGCCAGGGTA-3'）。

1. 3 试验设计

根据辛硫磷对鲫鱼的急性毒性试验结果（石旺荣，2011），选取0.0825、0.165和0.33 mg/L（1/40、1/20、1/10的96 h-LC50）分别作为试验组的低、中、高浓度值;对照组为丙酮（助溶剂）。由于辛硫磷见光易分解，因此整个试验过程均避光进行，期间持续充氧，不喂食，且每天及时清理水箱中的排泄物。采用半静态染毒法染毒鲫鱼，分别于染毒24、48、72和96 h后迅速剖解鲫鱼取出肝脏，一部分用于提取RNA，一部分用于提取肝微粒体，提取产物-80 ℃贮存备用。

1. 4 样品处理

参照陈大健（2006）的提取方法，采用差速离心法制备鲫鱼肝微粒体。取出鲫鱼肝脏，用0.1 mol/L PBS（pH 7.4）反复漂洗以去除红细胞，置于滤纸上除去多余液体后称重，转入手持式匀浆器，按1∶4（w/v）比例加入匀浆缓冲液，置冰浴中迅速匀浆。将匀浆液转入预冷的离心管中，4 ℃下12000×g离心20 min，弃上层乳白色脂质，收集上清液并转移至超高速离心管中，4 ℃下105000×g离心60 min，弃上清液，收集底部呈粉红色的沉淀（微粒体组分）。按每克肝脏加悬浮缓冲液1.0 mL，振荡匀后分装于离心管中，-80 ℃贮存备用。

1. 5 鲫鱼肝微粒体中CYP1A活性测定

CYP1A活性以其标志酶EROD活性表示，即采用EROD检测试剂盒进行测定，酶活性以U/L表示。

1. 6 CYP1A基因mRNA表达水平检测

利用动物组织/细胞总RNA提取试剂盒迅速提取鲫鱼肝脏RNA，采用紫外分光光度计检测OD260/OD280以检验RNA浓度和纯度，以1.0%琼脂糖凝胶电泳检测其完整性。按cDNA第一链合成试剂盒说明合成cDNA，-20 ℃保存备用。参照SYBR qPCR Mix试剂盒操作说明进行实时荧光定量PCR检测，扩增程序：95 ℃预变性5 min;95 ℃ 10 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 20 s，进行40个循环;以1 ℃/10 s的速率从65 ℃缓慢递增至95 ℃，连续测定样品的荧光强度以获取熔解曲线。采用2-ΔΔCt法计算目的基因的相对表达量。

1. 7 CYP1A蛋白表达水平检测

以差速离心法制备的肝微粒体蛋白经SDS-PAGE进行初步分离后切下目的条带，通过电转移至PVDF膜上（GAPDH转膜条件：200 mA，90 min;CYP1A转膜条件：200 mA，120 min），以含5%脱脂奶粉的TBST（封闭液）浸泡PVDF膜，室温摇床封闭2 h;以TBST稀释一抗，使PVDF膜浸泡于一抗孵育液中，4 ℃孵育过夜（GAPDH稀释比例1∶1000;CYP1A稀释比例1∶500），TBST充分洗涤PVDF膜5～6次，5 min/次;以TBST稀释HRP标记二抗（1∶50000），使PVDF膜浸泡于二抗孵育液中，37 ℃摇床孵育2 h，TBST充分洗涤PVDF膜5～6次，5 min/次;将ECL试剂中的增强液与过氧化物酶溶液按1∶1比例混匀，然后滴加于PVDF膜上，反应数分钟待荧光带明显后，用滤纸吸去多余的底物液，覆上保鲜膜，X光胶片压片后依次放入显影液显影、定影液定影，冲洗胶片。晾干胶片，扫描胶片，采用BandScan分析胶片灰度值。

1. 8 统计分析

采用SPSS 22.0进行统计分析，包括单因素方差分析（One-way ANOVA）和Duncan’s多重比较。使用GraphPad Prism 5.0进行图片处理。

2 结果与分析

2. 1 辛硫磷对鲫鱼肝微粒体中CYP1A活性的影响

以EROD活性反映CYP1A活性，辛硫磷对鲫鱼肝微粒体中CYP1A活性的影响见图1。整体上，辛硫磷对鲫鱼肝微粒体中CYP1A活性产生抑制作用。辛硫磷染毒24 h时，鲫鱼肝微粒体中CYP1A活性与辛硫磷存在明显的剂量—效应关系，即随辛硫磷浓度的增加，CYP1A活性抑制作用越明显;但其他染毒时间的剂量—效应影响均不明显。由图1还可看出，低、中、高浓度组间均存在明显的时间—效应关系，染毒时间越长，鲫鱼肝微粒体中CYP1A活性越低，至染毒96 h时，低、中、高浓度组鲫鱼肝微粒体中CYP1A活性分别较对照组下降54.7%、30.4%和65.5%，且差异极显著（P<0.01，下同）。

2. 2 辛硫磷对鲫鱼肝微粒体中CYP1A基因mRNA表达的影响

辛硫磷对鲫鱼肝微粒体中CYP1A基因mRNA表达的影响见图2。辛硫磷染毒后，鲫鱼肝微粒体中CYP1A基因mRNA的表达整体上呈明显下调趋势，其中，高浓度组染毒24、48、72和96 h时较对照组分别下调74.9%、65.6%、82.6%和71.4%，其差异均达极显著水平。在各辛硫磷染毒时间点，鲫鱼肝微粒体中CYP1A基因mRNA相对表达量与辛硫磷存在较强的剂量—效应关系，染毒48 h时CYP1A基因mRNA相对表达量与辛硫磷浓度呈正相关，其他染毒时间点则呈负相关，即CYP1A基因mRNA相对表达量随辛硫磷浓度的增加而降低。低、中浓度组鲫鱼肝微粒体中CYP1A基因mRNA相对表达量在染毒48 h时出现最低值，较对照组分别下调90.5%和76.8%，之后随染毒时间的延长其相对表达量逐渐上调;高浓度组鲫鱼肝微粒体中CYP1A基因mRNA相对表达量的最低值出现在辛硫磷染毒72 h时。

2. 3 辛硫磷对鲫鱼肝微粒体中CYP1A蛋白表达的影响

辛硫磷对鲫鱼肝微粒体中CYP1A蛋白表达的影响见图3。辛硫磷对鲫鱼肝微粒体中CYP1A蛋白表达的影响均达极显著水平，且呈明显的剂量—效应关系，即辛硫磷染毒浓度越高，鲫鱼肝微粒体中CYP1A蛋白表达量越低（图4）。辛硫磷对鲫鱼肝微粒体中CYP1A蛋白表达的影响还存在明显的时间—效应关系，至染毒96 h时，低、中、高浓度组鲫鱼肝微粒体中CYP1A蛋白表達量分别较对照组降低74.6%、82.6%和85.7%。

3 讨论

有机磷农药辛硫磷具有广谱高效、低成本等优点，已广泛应用于水产养殖的鱼病防治。据统计，我国每年用于虫害防治的辛硫磷达5000 t，其中约有80%直接进入生态环境，对生物体构成潜在危害（臧允亮等，2016;汪鹏鹏等，2017）。CYP1A是CYP450家族中的一个重要亚族，具有高效的催化能力和广泛的底物活性，许多前毒物及前致癌物代谢活性均与CYP1A密切相关（Tompkins and Wallace，2007;Zanger and Schwab，2013）。本研究结果表明，辛硫磷能抑制鲫鱼肝微粒体中的CYP1A活性，主要与CYP1A基因mRNA及其蛋白的表达量降低有关。在辛硫磷染毒初期（24 h），鲫鱼肝微粒体中CYP1A基因mRNA及其蛋白的表达量与CYP1A活性存在同步变化趋势，且呈明显的剂量—效应关系，推测CYP1A在辛硫磷染毒初期直接通过下调mRNA表达而影响其蛋白表达及酶活性，与外源性物质如恩诺沙星对鲫鱼肝脏CYP1A（Hu et al.，2011）、黄连素对鲫鱼肝脏CYP1A（Zhou et al.，2011）的影响相似。

本研究還发现，在辛硫磷染毒48 h时鲫鱼肝微粒体中CYP1A基因mRNA表达量与CYP1A蛋白表达量呈负相关，可能是在翻译过程中mRNA还受其他转录因子的调控，如芳烃受体（AhR）会介导原油影响下斑马鱼肝脏中CYP1A基因mRNA的转录（Sala-berria et al.，2014），且不同结构的AhR激动剂与β-连环蛋白在调控CYP1A基因表达过程中存在协同作用（Vaas et al.，2014）。此外，其他转录因子如氧化应激敏感的NF-κB在参与调控CYP450基因表达过程中也发挥重要作用，而且NF-κB和激活子蛋白-1（AP-1）能激活重金属胁迫下Hepa1c1c7小鼠肝癌细胞CYP1A1基因mRNA的转录过程（Korashy and El-Kadi，2008）。在转录后的调控和翻译过程中，mRNA和蛋白降解等因素也可能导致mRNA表达与蛋白表达水平不一致（Zanger and Schwab，2013）。本研究结果表明，辛硫磷对鲫鱼肝微粒体中CYP1A活性的抑制作用与CYP1A蛋白表达呈下调趋势有关，但也存在CYP1A蛋白表达量与CYP1A活性呈负相关的现象（染毒72和96 h时），可能与蛋白翻译后的修饰作用存在一定关联，CYP450翻译后的修饰方式包括磷酸化、泛素化和糖基化等，均会影响最终的酶活性（黎玉华等，2011）。

相对于辛硫磷的剂量—效应影响而言，辛硫磷对鲫鱼肝微粒体中CYP1A活性及其蛋白表达的时间—效应影响更明显。在3种不同辛硫磷染毒浓度处理组中，整体上表现为染毒时间越长其抑制作用越明显，可能是由于随着染毒时间的推移，鲫鱼体内未代谢完全的辛硫磷存在蓄积现象（刘茜，2009），进而导致CYP1A蛋白表达受抑制，最终影响酶活性。因此，在鲫鱼养殖过程中需格外注意辛硫磷在鱼塘中的施用时间，且施用时要控制药物残留问题。同时，可将鲫鱼CYP1A相关酶——EROD活性作为水环境污染的生物标志物，用于监控有机磷农药的污染情况，为水产养殖和饮用水安全提供一定的预警功能。此外，辛硫磷对鲫鱼肝微粒体中CYP1A蛋白表达产生的影响可能涉及转录因子介导的代谢通路及蛋白翻译后修饰等方面，其具体分子机制还有待进一步探究。除CYP1A外，CYP450酶系中CYP3A等亚型酶也占有很高的比例，根据本研究结果可推测辛硫磷对鲫鱼及其他鱼类的CYP450代谢亚型酶均产生一定影响，因此不同亚型酶间的相互作用机制也有待进一步研究验证。

4 结论

辛硫磷能抑制鲫鱼肝微粒体中CYP1A活性并下调CYP1A基因mRNA及其蛋白的表达;相对于辛硫磷产生的剂量—效应影响，其对CYP1A活性及其蛋白表达的时间—效应影响更明显。

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（責任编辑 兰宗宝）