水稻OsTFL2基因启动子的克隆及功能验证

刘芳 关和新 邱永福 陈立 张晓东 王心怡 韦清源 李虎 綦熿松

摘要：【目的】克隆水稻TFL2（OsTFL2）启动子序列，并分析其结构和功能，为深入研究OsTFL2基因对水稻开花和花发育的调控机理提供理论参考。【方法】采用同源克隆方法克隆OsTFL2基因启动子序列，利用PLACE和PlantCARE分析其结构和功能，并将其连接至携带β-葡萄糖苷酸酶（GUS）基因的pCAMBIA1301载体以构建pCAMBIA1301-Promoter植物表达载体，通过农杆菌介导转化水稻品种农垦58愈伤组织，通过对转基因植株进行GUS组织化学染色以分析该基因启动子的表达特性和调控功能。【结果】克隆获得的OsTFL2基因起始密码子上游启动子序列1.8 kb，该序列除含有真核生物典型启动子元件TATA-box和CAAT-box外，还含有花粉特异识别的顺式作用元件Pollen1lelat52（AGAAA）、开花基因转录相关的多功能转录因子CACTFTPPCA1（PACT，Y=C/T）、CCAAT box1（CCAAT）、DOFCORE（AAAG）和GATA box（GATA）、分生组织特异性元件CCGTCC-box及多个光诱导元件或光诱导相关元件如G-box、Box I、CATT-motif、GATA-motif和GT1-motif等，推測OsTFL2基因通过上述作用元件参与调控水稻花发育及开花。通过PCR检测共筛选获得16株阳性转基因植株，对其进行GUS组织化学染色，结果发现水稻的外颖、花、花药、柱头和子房中均可检测到明显的GUS色斑，而在叶片、茎尖和根尖无明显的GUS色斑，说明OsTFL2启动子能驱动GUS基因在水稻外颖、花药和子房中表达。【结论】OsTFL2基因启动子具有启动活性和组织表达特异性，可在一定程度上影响OsTFL2基因表达，对水稻花生长发育和开花发挥重要调控作用。

关键词： 水稻;开花;TFL2基因;启动子;转基因;GUS染色

中图分类号： S511.035.3                           文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2019）10-2188-08

Cloning and functional identification of rice OsTFL2 gene promoter

CHEN Li1， ZHANG Xiao-dong1， WANG Xin-yi1， WEI Qing-yuan1，2， LI Hu1，

QI Huang-song1， LIU Fang1， GUAN He-xin1， QIU Yong-fu1*

（1College of Agricultural/State Key Laboratory for Conservation and Utilization of Subtropical Agro-bioresources，

Guangxi University， Nanning  530004， China; 2Cash Crops Research Institute， Guangxi Academy of Agricultural Sciences， Nanning  530007， China）

Abstract：【Objective】The purpose was to clone the promoter sequence of gene OsTFL2 and then to study its structure and function，which would be favor for advanced mechanism analysis of rice flowering and flower development regulated by gene OsTFL2. 【Method】Homologous cloning method was applied to obtained the promoter sequence of OsTFL2 gene， PLACE and PlantCARE analysis were then conducted to analyze its structure and function. Furthermore，it was connected with vector pCAMBIA1301 carrying β-glucuronidase（GUS） gene to construct plant expression vector pCAMBIA1301-Promoter，which was then transferred to the callus tissue of rice variety Nongken 58 through agrobacterium induction. Finally，GUS staining method was conducted to detect the expression characterization and regulation function of the promoter with transgenic plants. 【Result】One 1.8-kb fragment of the upstream promoter sequence of OsTFL2 geneinitiation codon was cloned and it had typical promoter components of eukaryote，such as TATA box and CAAT-box. It also included the special cis-acting regulatory elements Pollen1lelat52（AGAAA），the specific multi-functional transcription factors that related to flowering genetic transcription CACTFTPPCA1（PACT，Y=C/T），CCAAT box1（CCAAT），DOFCORE（AAAG），and GATA box（GATA），the special component of meristem tissue CCGTCC-box，the light responsive elements G-box，Box I，CATT-motif，GATA-motif，and GT1-motif. The result suggested the OsTFL2 may regulate the flower development and flowering through the special elements. Furthermore，a total of 16 positive transgenic rice plants were obtained by PCR detection. The histochemical staining of GUS revealed that the GUS staining could be detected in the out glume，flower， anther，stigma and ovary of rice，but there were no obvious GUS staining in leaf， stem tip and root tip， which indicated the OsTFL2 promoter could be expressed in the out glume， anther and ovary. 【Conclusion】The cloned OsTFL2 promoter has promoting activity and shows tissue specific expression function，it affects expression of OsTFL2 gene to some extents and play a  role in regulation of flower development and flowering in rice.

Key words： rice（Oryza Sativa）; flowering; OsTFL2 gene; promoter; transgenic gene; GUS staining

0 引言

【研究意义】开花是植物生命周期中最重要的生长发育过程。水稻（Oryza sativa）作为我国重要的粮食作物，花的发育与其产量密切相关。随着分子遗传学技术的逐步完善，已发现大量参与调控植物开花的基因，如TFL2在植物花发育中发挥非常重要的作用（Guan et al.，2011）。研究表明，TFL2基因表达产物是异染色质相关蛋白1（Heterochro-matin-associated Protein1，HP1）的同系物LHP1（Gaudin et al.，2001;Kotake et al.，2003），HP1是多梳抑制复合物（Polycomb repressive complexes，PRCs）的重要组成成分，而PRCs通过抑制大量功能基因在花发育过程中发挥关键作用（Hecker et al.，2015）。因此，克隆水稻TFL2基因（OsTFL2）启动子，分析其结构与功能，以了解开花和成花机理，对延长水稻收获期、提高其产量及降低生产成本具有重要意义。【前人研究进展】目前，已有大量植物开花相关基因的研究报道，其中大多以模式植物拟南芥为研究对象。研究发现，拟南芥的FLOWERING LOCUS T（FT）和TERMINAL FLOWER1（TFL1）基因突变将改变花序的结构（Tsaftaris et al.，2012），且拟南芥中仅有一个HP1蛋白编码基因，即AtLHP1，也称为AtTFL2或AtTU8（Valdés et al.，2012;Berke and Snel，2015），其突变会导致早花、顶端花序、光周期敏感性低和植株矮小等表型（Rizzardi et al.，2011），也可抑制部分开花相关基因表达，如Pistillata（PI）、Sepallata3（SEP3）（Kotake et al.，2003）、Flowering Locus C（FLC）（Kotake et al.，2003;Mylne et al.，2006;Liu et al.，2009）、Flowering Locus T（Takada and Goto，2003;Nakahigashi et al.，2005）、AgmousAG（AG）（Sung et al.，2006）、Vernalization 1（VRN1）（Liu et al.，2009）等。此外，在其他植物如黄瓜、甘蔗和玉米中也发现了TFL2基因（Guan et al.，2011）。可见，TFL2基因在植物花发育中发挥非常重要的作用。随着分子技术的不断发展，研究人员发现许多转录因子可通过与基因启动子区域内各类元件相互作用以调控基因表达，从而实现对环境信号的应答反应及植物生长发育的调节（Le et al.，2010;Suzuki et al.，2011）。因此，分析目的基因启动子所含顺式作用元件可为深入了解基因结构与表达模式提供理论参考。研究发现，麻风树中MOTHER OF FT AND TFL1（JcMFT1）基因启动子含有生长调控元件，将该基因转入拟南芥后发现其在拟南芥种胚中表达，推测其与细胞分裂有关（Tao et al.，2014）;葡萄VvSCL9基因启动子具有逆境胁迫作用元件，将该基因转入烟草植株进行超表达，可明显提高植株对NaCl的耐受性，且花期也提前（陈立勇等，2014）;水稻OsGAR4基因为开花抑制因子，其启动子含多个激素响应作用元件，用赤霉素（GA3）处理水稻后，植株中OsGAR4基因表达量降低，从而促进水稻小穗的早期发育（刘秋华等，2015）。【本研究切入点】尽管在许多植物中发现了TFL2同源基因，但迄今关于OsTFL2基因启动子克隆及功能的研究鲜见报道。【拟解决的关键问题】克隆OsTFL2基因的启动子序列（Promoter），将其连接至携带β-葡萄糖苷酸酶（GUS）基因的pCAMBIA1301载体上从而构建重组植物表达载体，转化水稻后验证其生物学功能，检测OsTFL2基因启动子的表达特征，并对其启动活性和组织特异性表达功能进行分析，为深入研究OsTFL2基因对水稻开花和花发育的调控机理提供理论参考。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

供试水稻品种为农垦58。农垦58种子、农杆菌EHA105和pCAMBIA1301表达载体（含CaMV35S启动子和GUS基因系统的双元载体）均由广西大学农学院實验室保存提供。主要试剂：pUCm-T克隆载体购自TaKaRa公司;限制性内切酶Nco I和Hind III购自NEB公司;其他试剂均购自生工生物工程（上海）股份有限公司。主要设备仪器：Thermal Cycler PCR仪、Imagine Master VDS凝胶成像系统和超微量紫外可见分光光度计购自美国Bio-Rad公司;高速冷冻离心机购自德国Eppendoff公司;DYCZ-30型垂直电泳槽、DYY-12型电脑三恒多用电泳仪、WD-9405B型水平摇床和高通量组织研磨仪购自北京六一仪器厂。本研究所用的培养基配方如表1所示。

1. 2 试验方法

1. 2. 1 DNA提取与检测 水稻幼苗于4月移栽至大田，当长至4～5叶期时，每株取2 cm的幼嫩叶片，采用常规CTAB法提取其基因组DNA，并以1%琼脂糖凝胶电泳进行检测。

1. 2. 2 OsTFL2基因启动子克隆 从NCBI中搜索下载OsTFL2基因序列，并将其提交至启动子预测软件Promoter 2.0对该基因启动子进行预测，结果显示，该基因起始密码子ATG上游1800 bp处为启动子序列。根据该序列设计PCR扩增引物，正向引物：5'-CGCAAGCTTCGCCAAGAAGTAACAAACACA

GC-3'（下划线为Hind III酶切位点）;反向引物：5'-G

AATTCCCATGGGGCTACTCCTCTCTTTCTCGGA

T-3'（下划线为Nco I酶切位点）。上述引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。以基因组DNA为模板，PCR扩增OsTFL2基因启动子序列。PCR反应体系10.0 µL：10×Buffer 1.0 µL，10 µmol/L正、反向引物各0.4 µL，10 µmol/L dNTPs 0.1 µL，DNA模板1.0 µL，ddH2O补足至10.0 µL。扩增程序：94 ℃预变性4 min;94 ℃ 40 s， 55 ℃ 40 s，72 ℃ 1.5 min，进行35个循环;72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳进行检测。

切胶回收目的片段，将其连接至pUCm-T载体上，从而获得pUCm-T-Promoter重组质粒，并转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。通过菌落PCR检测和双酶切验证筛选出阳性克隆，将其送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序。将测序结果提交至Plant CARE和PLACE对OsTFL2基因启动子中的顺式作用元件进行分析。

1. 2. 3 植物表达载体构建与转化 分别用Hind III和Nco I对pCAMBIA1301载体和pUCm-T-Promoter 重组质粒进行双酶切，切胶回收目的片段，将克隆得到的OsTFL2基因启动子序列取代pCAMBIA1301载体中的CaMV35S启动子，并与GUS基因连接，从而构建pCAMBIA1301-Promoter植物表达载体。然后将其转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。通过菌落PCR检测和双酶切验证筛选出阳性克隆，将其送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序。

将构建的pCAMBIA1301-Promoter植物表达载体转化水稻愈伤组织中，具体操作：将未损伤的水稻种子脱壳后先用70%乙醇消毒3～5 min，再用0.1%升汞消毒20～30 min，然后用无菌水清洗6次后接入诱导培养基中，于26 ℃暗培养28 d，将诱导出的愈伤组织转接至继代培养基上培养28 d后转接至预培养培养基上，于26 ℃暗培养4 d，再将愈伤组织置于农杆菌EHA105菌液中侵染30 min，中间轻轻摇动数次，倒掉菌液，将愈伤组织放置灭菌滤纸上晾晒20 min，接入共培养培养基，于20 ℃暗培养3 d，愈伤组织用无菌水清洗8～10次后，用含头孢克肟的无菌水（300～500 mg/L）清洗2次，再用该无菌水浸泡30 min，期间轻轻摇动数次，将愈伤组织置于灭菌滤纸上晾晒20 min，接至筛选培养基，于26 ℃暗培养，每14 d转接至新的筛选培养基上，共筛选2次。最后，将愈伤组织接入分化培养基中，于16 h/8 h暗/光间隔培养，最终获得转基因水稻植株。

1. 2. 4 转基因植株的PCR鉴定 根据GUS基因的编码区序列设计其PCR扩增引物（正向引物：5'-GTCGCGCAAGACTGTAACCA-3';反向引物：5'-C

GGCGAAATTCCATACCTG-3'），用于检测T0代阳性转基因水稻植株。扩增产物预期长度为490 bp。

1. 2. 5 转基因植株的GUS组织化学染色 参考吴智丹等（2012）的方法对T0代转基因植株的不同组织器官（叶片、茎尖、根尖、外颖、花、花药、柱头和子房等）进行GUS组织化学染色。

2 结果与分析

2. 1 OsTFL2基因启动子的克隆结果

由图1可知，利用常规CTAB法从水稻幼嫩叶片中提取的基因组DNA大于10 kb，且主带清晰、降解少，符合实验要求。由图2-A可知，OsTFL2基因启动子的PCR产物约1.8 kb，与预期相符。

将OsTFL2基因启动子序列连接至pUCm-T载体上，并转化大肠杆菌DH5α感受态细胞中，挑取部分白色单菌落进行PCR检测，结果如图2-B所示，成功筛选出阳性克隆。同时，为了进一步确认目的片段已准确地连接至pUCm-T载体上，分别挑取部分阳性单菌落进行扩大培养，用碱裂解法提取质粒DNA并用Hind III和Nco I双酶切，结果如图2-C所示，双酶切产物中均出现目的条带，表明目标片段已连接至pUCm-T载体上。

2. 2 OsTFL2基因启动子序列分析结果

将PCR检测和双酶切鉴定为阳性的质粒进行测序分析，结果表明，启动子序列和载体嵌合的情况与预期完全一致，说明载体构建正确，可进行后续试验。将OsTFL2基因5'端上游调控区1.8 kb序列提交至启动子预测网站PLACE進行顺式作用元件预测分析，结果如表2所示。该序列除含有启动子元件TATA-box和CAAT-box外，还存在AT和GT富集区、花粉特异识别的顺式作用元件Pollen1lelat52（AGAAA）及开花基因转录相关的多功能转录因子CACTFTPPCA1（PACT，Y=C/T）、CCAAT box1（CCAAT）、DOFCORE（AAAG）和GATA box（GATA）等。此外，该启动子还含有分生组织特异性元件CCGTCC-box及多个光诱导元件或光诱导相关元件如G-box、Box I、CATT-motif、GATA-motif和GT1-motif等，推测OsTFL2基因通过上述顺式作用元件参与调控花发育及开花过程。

2. 3 植物表达载体的鉴定结果

构建pCAMBIA1301-Promoter植物表达载体转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取部分单菌落进行PCR检测，结果发现有多个单菌落能扩增出目标条带（图3-A），初步确定这些单菌落为阳性克隆。用碱裂解法提取阳性克隆的pCAMBIA1301-Promoter植物表达载体，分别用Hind III和Nco I对其进行双酶切，结果如图3-B所示，酶切后的片段长度与预期基本一致，表明OsTFL2基因启动子序列已连接至pCAMBIA1301表达载体。

2. 4 植物表达载体的转化

将构建的启动子表达载体转化水稻愈伤组织，如图3所示。将种子脱壳消毒后转入诱导培养基上（图4-A）培养28 d后产生愈伤组织（图4-B），继代培养28 d后产生淡黄色的愈伤组织（图4-C），再预培养4 d，可获得共培养的受体。将愈伤组织和农杆菌共培养3 d。经过2代（14 d/代）筛选后可见瘤状抗性愈伤组织（图4-D）。将生长旺盛的愈伤组织进行分化培养，14 d后愈伤组织出现绿点（图4-E），21 d后开始长出幼芽，接着长出根，最后将再生的植株转至生根壮苗培养基（图4-F）。

2. 5 转基因植株的鉴定及GUS组织化学染色结果

将生根壮苗培养获得的植株移栽至盛有大田土壤的桶里，培养14 d后，共获得22株存活的T0代转基因植株，利用GUS基因的引物对其进行PCR鉴定，结果显示，有16株可扩增出490 bp特异性条带（图5），说明其为阳性转基因植株。对16株阳性转基因植株的组织器官进行GUS组织化学染色，结果发现在水稻的外颖（图6-E）、花（图6-F）、花药（图6-G）、柱头（图6-H）和子房（图6-I）中均可检测到明显的GUS色斑，而在叶片（图6-A和图6-B）、茎尖（图6-C）和根尖（图6-D）无明显的GUS色斑，说明OsTFL2基因启动子能驱动GUS基因在水稻外颖、花药和子房中表达，推测OsTFL2基因的启动子可在一定程度上影响下游基因表达，在水稻花的生长发育过程中发挥重要调控作用。

3 讨论

基因表达调节对环境信号的应答反应及植物生长发育发挥重要作用，许多基因通过启动子序列中各类元件相互作用以调节基因表达，现已成为植物分子生物学和生理学研究的重点（Le et al.，2010;Suzuki et al.，2011）。因此，分析特定基因启动子内所含顺式作用元件为研究基因的结构、表达及调控模式提供理论参考。启动子主要由上游元件、核心启动子和应答元件组成。上游元件包括TATA-box、CAAT-box和GC-box等，其中TATA-box是植物基因启动子最典型的元件。本研究克隆OsTFL2基因启动子序列，该序列含9个TATA-box和18个CAAT-box，说明其具有典型的启动子特征;该序列还含10个花粉特异识别的顺式作用元件Pollen1lelat52（AGAAA）及开花基因转录相关的多功能转录因子CACTFTPPCA1（PACT，Y=C/T）、CCAAT box1（CCAAT）、DOFCORE（AAAG）和GATA box（GATA）等，其中，Pollen1lelat52（AGAAA）是調控花粉表达所必须的元件，推测OsTFL2基因受这些上游元件调控;此外，该启动子中还含有大量分生组织的特异性元件CCGTCC-box及光诱导元件或光诱导相关元件G-box等，推测OsTFL2基因通过上述作用元件参与调控花发育，且与光响应、衰老、花粉和花药发育相关，与Guan等（2011）的研究结论基本一致。Tsaftaris等（2012）研究发现，TFL2基因仅在花和芽的早期发育中表达，而在叶中不表达。本研究将OsTFL2基因启动子序列转化水稻品种农垦58中获得转基因植株，通过GUS组织化学染色检测发现，在水稻的外颖、花、花药、柱头和子房等组织中均可检测到明显的GUS色斑，而在叶片、茎尖和根尖等部位无明显的GUS色斑，该结果与Tsaftaris等（2012）的研究结果类似，说明OsTFL2基因的启动子可在一定程度上影响下游基因表达，在水稻花的生长发育过程中发挥重要调控作用。但Guan等（2011）研究表明，TFL2基因主要在拟南芥、水稻、玉米和甘蔗等的叶片和茎尖中大量表达，推测该基因具有组织特异性，对维持植株形态发挥重要作用。还有研究表明，TFL2基因突变会降低植物生长素合成速率，导致游离生长素含量降低，进而影响植株的重要生命过程。如拟南芥AtTFL2基因突变会影响花形成、叶和根的形态、光周期、株形、开花期、植物体内激素水平及温度的敏感性等（Kotake et al.，2003;Guan et al.，2011）。本课题组前期研究也发现，OsTFL2基因表达被抑制后，水稻表现出植株矮小、花畸形、开花期对光敏感性低等多个性状（Guan et al.，2011）。因此，在今后的研究中，应结合启动子的结构特征观察植株的表型特征，从而深入探究该基因启动子在不同花发育阶段受光、温等影响下的表达特征，以期明确启动子结构的组成及对应的生物学功能，从而解析转录调节的分子机制。

4 结论

OsTFL2基因启动子具有启动活性和组织表达特异性，可在一定程度上影响OsTFL2基因表达，对水稻花生长发育和开花发挥重要调控作用。

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（責任编辑 陈 燕）