猪细小病毒分子病原学研究进展

翟银建 沈学怀 潘孝成 赵瑞宏

摘要：猪细小病毒能引起母猪以初产发生流产、不孕，产死胎、畸形胎、木乃伊胎及弱仔等为特征的猪，繁殖障碍性疾病。猪细小病毒病在世界各地的猪场广泛流行，给养猪产业带来严重的损失。该文主要对猪细小病毒的生物学特性、致病机理及分子结构特性等方面的研究进展进行阐述，以期为猪细小病毒病的研究和防控提供参考。关键词：猪细小病毒;分子病原学;生物学特性;致病机理;分子结构中图分类号：S855.3

文献标识码：B

doi：1 0.3969/j .issn.2096-3637.2019.11 .009

引言

猪细小病毒病是由猪细小病毒（ Porcine parvovlrus，PPV）引起母猪繁殖机能障碍的主要疾病之一，主要导致母猪特别是初产母猪流产，产出死胎、畸形胎、木乃伊胎及病弱仔猪，以及部分仔猪关节炎和腹泻等症状[1-3]。德国科学家Mary和Mahnel在1966年进行猪瘟病毒组织培养时首次发现猪细小病毒，首次证明了其致病性。1967年，Huygelen研究团队在猪肾细胞培养物中也分离到了一株细小病毒，并在次年证明该病毒为DNA病毒[4]。白20世纪60年代，从欧洲、亚洲、美洲等多个国家和地区相继分离出该病毒，我国于1982年和1985年由潘雪珠等分离到2株该病毒，分别命名为PPVS-1株和PPVS-2株[5-6]。目前该病呈现世界性分布并在大多数地区呈地方流行性，而且该病感染母猪后无明显临床症状，很容易造成广泛传播，给养猪业造成了巨大的经济损失，严重影响和制约养猪业的发展[2]。

PPV病原生物学特性

1.1 PPV形态特征及分类

PPV是一种较小、外观呈现六角形或圆形、二十面等轴立体对称的无囊膜病毒，通过电镜观察，直径约为20-26nm，能通过42nm的滤器，衣壳由32个壳粒组成[8]，PPV病毒粒子通常有2种形式，一种是含有核酸和衣壳的完全病毒，另一种是没有核酸只有衣壳且衣壳呈中空的病毒，2种存在形式的PPV在氯化铯中的浮密度分别为1.39 g/mL和1.30g/mL，虽然存在形式不同，但都可凝集红细胞[9]。PPV属于细小病毒科、细小病毒属成员，是目前动物病毒中仅次于圆环病毒的最小最简单的一类单链线状DNA病毒。目前发现的犬细小病毒（Canine parvovirus）、鼠细小病毒（ Mice Minutevirus）、鹅细小病毒（Gooseparvovirus）等与PPV都同属细小病毒属的成员，并且这些同属的细小病毒在进化关系上具有很高的同源性[10]。

1.2 PPV理化性质

PPV具有较强的耐热性，56℃条件下处理30 min后病毒的血凝性和传染性都没有明显变化，70℃处理后感染能力仍未丧失，只有略微下降，80℃处理5min，才会失去感染力和血凝性[11-12]。PPV在4℃条件下长期稳定，在-20℃条件下其毒力可以保存1年以上不受影响[13]。PPV对酶、脂溶剂及有机溶剂同样也具有很强的抵抗力，对常规消毒剂有一定的抵抗力，在罔舍及排泄物等白然條件下可存活14周以上，PPV对酸碱具有很强的耐受性，pH在3.0-10.0范围内不影响病毒的感染能力，通常在0 5%氢氧化钠、2%戊二醛或3%甲醛长时间作用下才能使病毒灭活[14]。研究发现，PPV在体外培养增殖时在胰酶的短时间作用不仅对病毒悬液的感染性没有影响，反而可增加病毒复制的滴度[15]。

1.3 PPV体外培养特性

PPV的细胞适应性广泛，可以在猪原代细胞、次代细胞或传代细胞，包括猪睾丸细胞系、猪肾细胞系、牛肾细胞系等细胞系上复制增殖，甚至可在Hela、Hep-2等人的细脆系上正常生长[16]。PPV的细胞培养接毒与其他病毒培养的方法有明显区别，接种时机应在细胞增殖最旺盛时，通常是待细胞铺壁占细胞瓶的1/2或1/3时接毒，这是由于PPV需要依靠宿主细胞DNA聚合酶进行病毒自身核酸的复制，当接种条件适当时，通常接种后2-3d即可出现明显的细胞病变[17]。虽然PPV可以在多种细胞上进行增殖，但其对不同种类细胞的适应性有明显差异，研究证实PPV对猪睾丸细胞系（ST细胞系）的适应性最好，猪肾细胞系（PK-1 5细胞系）[18]。PPV在细胞中多次传代后，以空病毒粒子形式出现的病毒颗粒比例会升高，进而会抑制病毒的复制，因此，体外高传代培养病毒时，病毒滴度会有较为明显的降低[19]。PPV还存在接毒时间、剂量的依赖性差异，李智力等人通过对PPV接毒时间TOI、MOI和收毒时间进行优化，成功建立了基于PK-15细胞反应器微载体悬浮培养的PPV培养工艺，在5L反应器上最大病毒滴度达到107.2TCID50/mL，并首次发现乳酸对葡萄糖得率与病毒滴度具有正相关性[20]。

PPV感染临床症状及致病机理

PPV感染以母猪的繁殖障碍为主要特征，即产死产、木乃伊胎、胚胎死亡和不孕，在急性感染条件下，虽然没有明显的临床表现，但在发病母猪和仔猪的器官和组织内发现有大量PPV才存在。母猪在怀孕期感染PPV往往不会引起明显的特征性病变，但其可能引起子宫内膜轻度炎症、子宫上皮组织和固有层出现弥漫性或者局灶性的单核细胞浸润、妊娠黄体萎缩、胎盘钙化等症状;流产死胎肝脏、脾脏、肾脏等明显肿大、质地变脆、色素暗沉等;感染的体弱仔猪产m后，在四肢及颈胸部的内侧出现淤血斑，并有m血现象，全身皮肤黏膜发绀，最后衰竭死亡;感染死胎经组织病理学观察，可在组织器官内发现大量细胞坏死和核内包涵体，大脑出现特征性的脑膜炎病变[21-22]。研究表明，PPV与猪的消瘦综合征以及猪的非化脓性心肌炎有关[23]。张洪玲[24]对PPV诱导猪胎盘滋养层细胞凋亡的分子机制研究发现，PPV可通过激活p53介导的线粒体通路诱导PK-15细胞凋亡，PPV感染原代和永生化猪胎盘滋养层细胞，通过激活细胞内Fas/FasL介导的通路和p53介导的线粒体通路诱导猪胎盘滋养层细胞凋亡。张棵[25]研究PPV感染对黄体细胞的影响时发现，PPV感染激活了p53信号通路，并通过活化的p53调控线粒体通路诱导黄体细胞凋亡，并可通过下调孕酮合成过程中的关键蛋白StAR及关键酶3B-HSD和CYPllA1的表达，抑制黄体细胞孕酮的合成。张岳研究表明PPV感染ST细胞后可诱导细胞白噬的发生，而且白噬的发生反向促进病毒的复制，并揭示了atg5基因在其中发挥的重要作用，该研究为探明PPV的致病机理提供新的理论依据[26]。

PPV分子结构特征

3.1 PPV基因组结构

PPV是能够白主复制的单链线状DNA病毒，大小约为5000bp，成熟的病毒粒子仅含有负链DNA基因组。由于病毒单链基因很容易发生折叠，进而结合构成Y形发夹结构和U形发夹等二级结构[27]。成熟病毒粒子DNA的3端Y字形结构由120个核苷酸构成，根部有80个核苷酸形成，Y字上部40个核苷酸构成，其中3端的部分基因是保守序列;5'端U形结构由127nt构成，是通过1个24nt的短回文序列截断了5'端127nt处的回文序列折叠而成，5'端环状结构（Loop）在对病毒核酸的复制发挥重要作用，如果丢失PPV将无法复制，但如果在5'端核酸70-80个核苷酸的位置发生少量的基因丢失，并不会对PPV在宿中细胞中的核酸复制产生影响[25]。PPV具有ORF1和ORF2 2个开放阅读框，5'端的开放阅读框负责编码非结构蛋白，3'端的开放阅读框负责编码结构蛋白，其中由P4早期启动子转录的NS1和NS22个非结构蛋白对病毒DNA的复制发挥重要作用;晚期启动子P40转录结构蛋白VPI和VP2，两者以1：10的比例组装形成直径约20-25nm的核衣壳[29]。VP2结构蛋白完全包含于VP1蛋白中，并与之重叠，VP3结构蛋白则由VP2蛋白切割形成，所以转录的mRNAs都终止于94-96mu的Poly （A）终止信号处[30]。

3.2 PPV的DNA复制与转录

PPV的复制需要借助宿主细胞的体系完成，当细胞处于旺盛的有丝分裂时，细胞内积聚的DNA聚合酶可以被PPV用于合成白身基因组，因此，处于细胞周期S期的晚期和G2期早期的细胞最有利于该病毒的复制。在PPV基因组复制过程中，其3'端可进行自我回折，产生DNA聚合酶所需引物-OH，因此PPV的复制过程不需要DNA环化和RNA引物的作用，在DNA聚合酶的作用下，从PPV基因组3'端Y型发夹结构起始合成互补链，将感染的亲代DNA转变为双链复制型DNA，然后以合成的正反链DNA为模板，合成子代病毒组装所需的DNA和转录mRNA[31]。

PPV感染宿主细胞后，早期启动子P4从基因组的225核苷酸处起始转录，产生的原始转录物为PT4;晚期启动子P40从2035核苷酸处起始转录，产生转录物PT40，2个转录共同终止于poly （A）的终止转录信号区。PT4分别经过C型拼接、D型拼接或者不进行拼接，产生大量的次级转录基因，分别翻译为结构和非结构蛋白。编码161个氨基酸的非结构蛋白NS2（ 18.1KD），该蛋白N端的86个氨基酸与NSI完全相同，NS2独有的75个氨基酸分布在蛋白的C末端;非结构蛋白NS3（12.4KD）由106个氨基酸构成，其N端的86个氨基酸序列与NSI完全一致，C端的20个氨基酸与NS1不同，但与VP1编码区重叠，然而目前仍没有明确的证据证明PPV感染的细胞中存在NS3蛋白;PT4不经过拼接产生非结构蛋白NS1，由663个氨基酸构成;PT40通过B型拼接产生约29 kb的VPlmRNA，经过A型拼接产生约29kb的VP2 mRNA，VPI mRNA和VP2 mRNA从不同位置的ATG起始翻译，产生2种结构蛋白VPI（80.9KD）和VP2（6.43KD）[32].

3.3 PPV主要结构蛋白及功能

PPV基因组编码3种结构蛋白，分别是分子质量为83KD的VP1、为64KD的VP2和60KD的VP3，均是由基因组右侧的ORF编码，而VP3不是由mRNA翻译的产物，则是VP2水解后的产物[33]。在VP1蛋白的N端存在一个脯氨酸积聚区域，该区域在介导PPV进入宿主细胞中发挥关键作用;VP2是具有红细胞凝集功能的蛋白，同时也是构成病毒壳表面蛋白的主要成分，此外，VP2蛋白还可以进行自我装配，形成类病毒的蛋白粒子，陔蛋白粒子具有良好的免疫原性，能够诱导细胞产生强烈的免疫反应[34]。宋文博[35等通过PCR扩增8株PPV毒株的VP2基因，通过测序比对发现，不同分离毒株的VP2蛋白氨基酸同源性较高，仅存在个别氨基酸位点的差异，同时也构建了rPRVSMX-VP2重组毒株，通过小鼠安全性试验证明：rPRVSMX-VP2可诱导小鼠产生与载体毒相当水平的PPV抗体，诱导产生的PPV血凝抑制抗体（HI抗体）可达到1：27。VP1、VP2和VP33种蛋白是PPV的结构蛋白，也是具有良好免疫原性的蛋白，Mollter[36]等分別用VP1、VP2和VP3 3种蛋白免疫家兔均能诱导产生抑制血凝抗体和中和抗体，并且血凝抑制抗体滴度和中和滴度具有平行关系，并且发现在猪细小病毒的结构蛋白上存在3个抗原表位区，分别是病毒蛋白转角结构区Loopl和Loop3近区域、二折叠下陷和三折叠突起区之间和邻近三折叠中心区，这些外露的抗原表位区域，可诱导机体产生中和性抗体。

3.4

PPV主要非结构蛋白及功能

PPV基因组编码3种非结构蛋白，分别是分子质量为78.5 KD的NS1、18.1 KD的NS1、12.4KD的NS3，均是由基因组左侧的ORF编码，NSI和NS22种非结构蛋白均是从P4启动子开始转录，2种非结构蛋白在病毒的复制和包装中发挥十分重要的作用[37]。近年的研究发现，除NSI和NS22种非结构蛋白外，SAT蛋白也是一个晚期的NS蛋白，其转录南晚期启动子调控，但目前关于SAT蛋白的研究很少，其生物学作用仍然不清楚[38]。NS1蛋白是由经拼接大小为4.7kb的mRNA翻译产生，其含有细小病毒属病毒共有的保守守序列[39]。孙秀[40]对分离到的45株PPV毒株的NSI基因进行克隆，并对基因序列进行测定，结果发现，NSI核酸序列同源性性达98.2% - gg.g%，氨基酸序列同源性为98.0%-99.7%，结果同样表明PPV的NSI基因具有高度的同源性，通过对氨基酸序列的比对分析，发现相对容易突变的氨基酸位点有12个，其氨基酸位点依次为55（V→A）、59（N→D）、164（V→A）、195（R→K）、242（G→S）、358（S→G）、544（ A→S）、562（ K→R）、568 （M→I）、579（Q→K，Q→P）、590（ D→N）和633（ I→M，I→V）。研究发现，NS1蛋白在细小病毒的组装过程中发挥重要作用，在病毒新复制的单链DNA基因组的5'末端通过共价健与NS1连结，随后在病毒转配过程中NS1被移除，并且连在病毒粒子的外层[41]。非结构蛋白NSI同样具有抗原性，并虽然其含量很低，但在病毒复制时能持续刺激机体产生抗体。PPV的NS2蛋白南161个氨基酸构成，NS2蛋白的表达对宿主细胞有一定的选择性，不是在所有的宿主细胞中都能表达NS2蛋白，只在相适应宿主细胞中才会表达[42]。由于NS2蛋白和NS3蛋白相对较小，对这2种非结构蛋白的研究较少，对其承担的生物学功能和意义仍然不十分清楚，有待进一步研究。

结束语

PPV早期的研究主要集中于病原学、理化性质、防治措施等方面，白20世纪80年代，各国的研究者逐渐加强了关于PPV分子结构和基因组成等方面研究。目前，对PPV的分子结构特征有了较为清楚的了解，但是对于VP3的功能研究、NSI调节P40启动子、PPV基因组的同源性高但毒力存在很大差异以及对其二级结构的研究仅限于3'端等问题仍不清楚，有待进一步研究。

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