探讨间接免疫荧光法检测呼吸道病毒九联检的影响因素

冯艳鹏 皮敏

关键词：间接免疫荧光;呼吸道病毒;影响因素

呼吸道感染有70%-80%由病毒引起的，包括腺病毒，冠状病毒，腺病毒，流感病毒和副流感病毒，呼吸道合胞病毒埃可病毒和柯萨奇病毒。另有20%-30%的呼吸道感染是由细菌引起的如：流感嗜血杆菌，嗜肺军团菌，肺炎链球菌，葡萄球菌等【1-1】。还有肺炎支原体，肺炎衣原体，立克次体，真菌等引起的感染。感染病原体种类多，不仅是单一病原体感染，还有混合多种病原体感染，病原体多种耐药，给疾病的诊断和治疗增加了难度。因此呼吸道病原体的及时检测，对查出病原体诊断呼吸道感染性疾病具有重要意义。

检测呼吸道病原体的方法很多，例如细菌及真菌的培养及药敏，酶联免疫吸附试验，分子生物学等。细菌及真菌取决于标本的采样，病原体的营养条件，生存环境，培养周期长，定植还是污染难以区分，检测繁琐等难以满足临床需要。一次…简便快速检测出多种病原体的实验技术能够为临床医生的诊断提供很大的帮助。如郑州安图公司的呼吸道病毒九聯检试剂采用间接免疫荧光法，引用进口技术可在一张玻片上同时检测嗜肺军团菌，肺炎支原体，肺炎衣原体，Q热立克次体，呼吸道合胞病毒，腺病毒，甲型流感病毒，乙型流感病毒，副流感病毒九种病原体，检测采样简单，操作容易，准确可靠为临床的诊治提供有效的依据。呼吸道病毒九联检的检测包括标本的采集，标本和试剂的平衡，加样温浴洗涤，晾片，封闭，阅片，结果判读每个环节都至关重要，任何操作不当都会影响结果的判读主要有以下影响因素：

1 标本的采集  采集合格的标本是保证质量的前提。因为标本采集的是血清含有IgG和IgM，需要分离IgG，样本乳糜溶血等，样本量过少会无法完成检测，带入沉淀会假阳性，过多会影响结果判读的背景。加入吸附剂需要充分振荡混匀，离心沉淀13000转/分钟，离心10分钟。上清液中尽量不含有IgG.

2 试剂平衡，温浴，加样 试剂与标本从冰箱取出后需要在室温平衡30分钟后再操作。温浴第一次是抗原抗体的结合37℃90分钟，水浴箱的温度要及时检测，保证检测结果的准确。 加样时需加入检测孔内，不能触及底部，更不能溢出，加样枪及时校准。

3 洗涤  洗涤是检测中最关键的一个环节，用磷酸盐缓冲液冲洗时注意掌握力度，操作生不能直接对着检测孔冲洗以免造成假阴性。放入洗盒后置水平摇床10分钟，手工振荡时频率不能太快，以免洗掉反应物造成假阴性。

4 晾干玻片时采用自然风干，不能用热的吹风机吹，导致反应物变性。

5 加封闭介质，加太少导致视野不清楚。太多会溢出玻片影响阅片

6 镜检 玻片制备完毕后避光，荧光剂会见光分解变弱。镜检集中阅片，最好在1小时内看完，时间过长荧光会变弱或消失，导致假阴性。如果不能及时阅片请放入2-8℃冰箱避光保存，24小时内看完。

7 结果判读：第10孔是对照孔，洗涤背景的好坏都取决于这一孔，当然不排除抗核抗体阳性标本的干扰，嗜肺军团菌，肺炎衣原体，Q热立克次体是黑色背景，需要荧光显微镜的亮度要足够，仔细观察成杆状，点状，球杆状黄绿色荧光。肺炎支原体需要视野下50%视野整个细胞都有黄绿色荧光才是阳性。甲型流感病毒，乙型流感病毒，副流感病毒存在相同的基因可能会有第7.8.9孔同时阳性，察每个视野3-5个细胞荧光强度强者才是阳性。还有存在加完荧光剂沉积在检测孔边缘，会导致边缘效应，一定要纵观全片综合判断。

总之，间接免疫荧光法检测呼吸道病毒九联检，操作简单，灵敏度高，特异性好，为临床治疗呼吸道感染提供可靠的依据。操作过程中重视检验前，检验中，检验后的质量控制注重每一个环节，才能保证检验结果的准确。

参考文献：

[1]王辉，任健康，王明贵 .临床微生物学检验[M].人民卫生出版社.2015：49.

[2]陈华根 .间接免疫荧光法检测呼吸道病原体质量控制[J].检验医学与临床2014，11（21）：3086-3087.