小粒种咖啡种质资源重要农艺性状遗传多样性分析

闫林 陈婷 黄丽芳 李锦红 马关润 王晓阳 董云萍 龙宇宙 李学俊

摘要：[目的]分析小粒种咖啡种质资源农艺性状和品质性状的多样性，为小粒种咖啡品种选育提供科学依据。[方法]以60份小粒种咖啡种质资源为材料，进行8个农艺性状和5个品质性状测定，并采用相关性分析、主成分分析和聚类分析等方法进行多样性分析。[结果]在8个农艺性状中，变异系数以鲜干比最高（25.15%），其次为鲜果重（19.85%），以出米率最低（1.97%）;遗传多样性指数以种子长为最高（2.04）。在5个品质性状中，变异系数以绿原酸最高（22.68%），其次为脂肪（12.40%），蛋白质为最低（5.20%）;遗传多样性指数以绿原酸最高（2.07），其次为脂肪（2.06）和蛋白质（2.05）。性状相关性分析结果表明，干豆重与出米率呈顯著正相关，种子大小与百粒重、出米率、蛋白质呈极显著正相关，百粒重与出米率、蛋白质、脂肪呈极显著正相关，出米率与蛋白质、脂肪呈极显著正相关，蛋白质与脂肪呈极显著正相关，咖啡因与蔗糖呈极显著负相关。主成分分析结果表明，前4个主成分因子（PCI、PC2、PC3、PC4）包含了12个农艺性状，累计贡献率达69.17%，表明这些性状是造成小粒种咖啡种质多样性的主要因素。聚类分析结果表明，60份小粒种咖啡种质可分为两个大类群，第1类群有53份资源，第Ⅱ类群有7份资源。第Ⅱ类群的鲜果重大，尤其是II-2类群的鲜果重和干豆重。[结论]60份咖啡种质资源存在丰富的遗传多样性，可通过引种驯化、杂交、嫁接和分子育种等技术将其优异基因延续下去。第Ⅱ-2类种质的鲜果重和干豆重大，可作为选育和改良品种的基本材料。

关键词：小粒种咖啡;农艺性状;遗传多样性;相关性分析;主成分分析;聚类分析

中图分类号：S571.2文献标志码：A 文章编号：1008-0384（2019）12-1379-09

0 引言

[研究意义]咖啡与可可、茶并称为三大饮料作物，主要分布在拉丁美洲、亚洲及非洲等热带地区，2017年咖啡收获面积1.09×10万hm、产量921万t。咖啡属Coffea约有100多个种，生产栽培的主要有小粒种（Coffea arabica L）和中粒种（Coffeacanephora Pierre），小粒种约占总产量的60%、中粒种约占总产量的40%。我国引种咖啡已有100多年历史，主要分布在云南、海南、四川、台湾等地区，经过十多年的发展，目前已形成云南、四川小粒种咖啡优势产区和海南中粒种咖啡优势产区，2018年全国种植面积12万hm，年产量17万t、农业产值20多亿元，是产区农民脱贫致富的主要经济来源。然而，我国咖啡产业存在种植品种单一、品质较差和比较效益偏低等突出问题，加强优良咖啡品种选育势在必行。因此，开展咖啡种质资源鉴定评价及遗传多样性研究，对咖啡优良品种的选育及咖啡产业发展均具有重要意义。[前人研究进展]我国收集保存了大量的咖啡种质资源并进行分析评价。周华等通过对其根、茎、叶、花、果等进行评价，明确了不同性状的表型分类。白学慧等对96份咖啡种质抗锈病性状进行了评价。一些学者采用基于DNA水平的各种分子标记技术对我国咖啡种质资源进行了遗传多样性分析，明确其亲缘关系。植物表型性状标记具有简单、明显和易于识别的特征，是进行种质资源鉴定和描述等研究最直接和最基本的方法和手段。聚类分析可揭示种质资源个体间的遗传相似性，还能表明类群间的遗传差异和相互间的亲缘关系。主成分分析可揭示种质资源的生物学特点和生物学意义，能从多个因素指标中找出数量较少并能控制所有变量因子的主成分，其中每个主成分都能反映原始变量的大部分信息，且所含信息互不重复。聚类分析和主成分分析可为作物种质资源鉴定评价和分类提供参考依据，已在豌豆、陆地棉’、甜高粱等作物进行了相关研究。[本研究切入点]表型性状鉴定是咖啡种质资源研究最基本的途径，咖啡因、绿原酸、蛋白质、脂肪及蔗糖等主要生化成分是咖啡风味及营养价值的主要决定因素。虽然我国收集保存了大量的咖啡种质资源，但许多种质资源尚未充分鉴定评价与开发利用，因而加强咖啡种质资源鉴定评价是咖啡新品种选育研究的重要基础工作。目前未见应用聚类分析及主成分分析方法对咖啡种质资源主要农艺性状和品质性状进行鉴定和分析评价的报道。[拟解决的关键问题]本研究以60份小粒种咖啡种质为试验材料，测量其8个农艺性状和5个品质性状，采用相关性分析、主成分分析和聚类分析相结合的方法，综合分析咖啡种质农艺性状和品质性状的遗传多样性，以期筛选优良种质或发掘咖啡资源的优异性状，为有效保护咖啡种质资源及品种改良提供参考。

1材料与方法

1.1 供试材料

供试材料为60份小粒种咖啡种质（表1），取自德宏热带农业科学研究所（农业部瑞丽咖啡种质资源圃），主要为波邦、铁皮卡、卡杜艾、卡蒂姆、卡杜拉、萨其姆等品种类型。

1.2 试验方法

1.2.1 农艺性状测定鲜果重（kg）：在果实盛熟期，采摘单株鲜果，并称取其重量，待全株果实采收结束时统计单株成熟鲜果重量。

干豆重（g）：在果实盛熟期，采摘鲜果。去中果皮，洗掉种子表面果胶，置于50℃烘箱烘72h，至带种皮豆含水量约为12%时，测得的数据即为干豆重。

种子大小（长、宽、厚）：随机抽取20粒种子。用游标卡尺测量每粒种子基部至顶部的长度，即为种子长;种子最大横切面的最大直径，即为种子宽;种子最大横切面的最小直径，即为种子厚。

鲜干比（%）：带种皮豆样品，去种皮制成标准商品豆，计算商品豆重占鲜果重的比例，重复3次，计算平均值。

百粒重（g）：随机取100粒带种皮豆称重，重复3次，计算平均值。

出米率（%）：随机称取（100+1）g带种皮豆样品，去种皮制成标准商品豆并称重，计算商品豆质量占带种皮豆质量的比例，重复3次，计算平均值。

1.2.2 品质性状测定咖啡因按GB/T 5009.139-2014的方法测定，绿原酸按GB/T 22250-2008的方法测定，蔗糖按GB 5009.8-2016第二法测定，蛋白质用杜马斯燃烧法测定。

脂肪测定采用项目组先前研制的“咖啡脂肪含量测定的超声超离方法，将样品与石油醚混合液超声提取（60℃水浴、时间3～7min、功率250W），通过冷冻离心分离固相与液相（温度4℃、转速5000～8000r·min、时间5～9min），烘干固相物质，计算脂肪含量。

1.2.3数据分析采用Microsoft Excel 2007软件进行数据处理，计算平均值、标准差和变异系数，并参照谢向誉等的方法计算遗传多样性指数（H’），即H’=-∑PilnPi，Pi为性状第i级别内材料份数占总份数的百分比。采用SPSS 19.0软件进行相关性分析和主成分分析，利用k-均值分类法进行聚类分析。

2 结果与分析

2.1 农艺性状表型评价

不同咖啡种质农艺性状变化较大，统计分析结果见表2。鲜果重变幅为0.79～2.97kg，平均1.87kg;干豆重变幅为300.49～592.68g，平均390.58g;鲜干比变幅为16.55%～48.79%，平均21.50%;种子长变幅为10.74～12.69mm，平均11.74mm;种子宽变幅为7.36～9.05mm，平均7.98mm;种子厚变幅为4.40～5.70mm，平均4.88mm;百粒重变幅为15.06～27.13g，平均19.51g;出米率变幅为78.63%～86.60%，平均84.01%。

由表2可知，60份咖啡种质农艺性状存在很大差异，8个农艺性状的变异系数变幅为1.97%～25.15%，差异非常明显。变异系数的大小顺序为鲜干比>鲜果重>干豆重>百粒重>种子厚>种子宽>种子长>出米率。8个农艺性状中，变异系数以鲜干比最高（变异系数为25.15%），鲜干比最大值为48.79%、最小值为16.55%;其次是鲜果重（变异系数为19.85%），鲜果重最大值为2.97kg、最小值为0.79kg;以出米率变异系数最低（变异系数为1.97%），出米率最大值为86.80%、最小值为78.63%。鲜干比、鲜果重、干豆重变异系数大，说明这些性状存在着丰富的变异，具有较好的遗传改良基础。出米率、种子长、种子厚的变异系数较小，说明他们一致性较强，具有较稳定的遗传特性。

8个农艺性状的遗传多样性指数在1.43～2.04，其遗传多样性指数由高到低依次为种子长>种子厚>种子宽、出米率>干豆重>鲜果重、百粒重>鲜干比。种子长的遗传多样性指数最高，其后依次是种子厚、种子宽和出米率，说明种子大小具有丰富的遗传多样性，但由于他们的变异系数较小，基于种子大小对咖啡种质资源改良筛选潜力较小。鲜干比的遺传多样性指数最低，遗传多样性较窄。综上所述，60份咖啡种质资源的8个农艺性状存在较明显的差异，表现出不同程度的遗传多样性。

2.2 品质性状评价

不同咖啡种质品质性状变化较大，统计分析结果见表3。蛋白质变幅为11.98%～15.43%，平均13.40%;脂肪变幅为9.03%～15.91%，平均13.02%;绿原酸变幅为8.10～24.56mg·g，平均16.59mg·g;咖啡因变幅为7.62～11.80mg·g，平均9.89mg·g;蔗糖变幅为7.10～10.00g·hg，平均8.48g·hg。

60份咖啡种质品质性状存在很大差异，蛋白质、绿原酸等5个性状的变异系数为5.2%～22.68%，差异非常明显。在5个品质性状表现中，变异系数的大小顺序为绿原酸>脂肪>咖啡因>蔗糖>蛋白质。绿原酸变异系数最大，最高含量为24.56mg·g、最低含量仅为8.10mg·g、平均值为16.59mg·g，说明绿原酸离散程度较大，稳定性较差，具有较好的遗传改良基础;脂肪的变异系数次之，为12.40%;咖啡因和蔗糖的变异系数分别为9.84%和9.42%;蛋白质变异系数最小，为5.20%。蛋白质、蔗糖、咖啡因的变异系数均较小，说明他们一致性较强，具有较稳定的遗传特性。

5个品质性状遗传多样性指数在0.55～2.07，其遗传多样性指数由高到低依次为绿原酸>脂肪>蛋白质>咖啡因>蔗糖。绿原酸遗传多样性指数最高（2.07），说明具有丰富的遗传多样性，而且其变异系数也最大（22.68%），表明基于绿原酸对咖啡种质资源筛选改良潜力较大。脂肪（2.06）、蛋白质（2.05）和咖啡因（1.99）的遗传多样性指数也较高，说明这些性状具有丰富的遗传多样性，但其变异系数较小，基于这些性状对咖啡种质资源进行改良筛选的潜力较有限。蔗糖的遗传多样性指数最低，说明供试咖啡种质在蔗糖方面的遗传多样性最小。综上所述，供试咖啡种质的主要品质性状具有丰富的遗传多样性。

2.3 农艺性状、品质性状的相关性分析

对咖啡农艺性状和品质性状进行统计和分析（表4），结果表明，鲜果重与绿原酸呈极显著负相关;干豆重与鲜干比、种子长、蛋白质呈极显著正相关，与出米率呈显著正相关，其中与种子长和鲜干比的相关系数分别为0.755和0.714，明显大于与其他性状间的相关系数，说明干豆重与种子长和鲜干比存在紧密关联;鲜干比与种子长呈极显著正相关;种子长与百粒重、出米率、蛋白质呈极显著正相关，与蔗糖呈显著正相关;种子厚与百粒重、出米率、蛋白质呈极显著正相关，与脂肪呈显著正相关;百粒重与出米率、蛋白质、脂肪呈极显著正相关;出米率与蛋白质、脂肪呈极显著正相关;蛋白质与脂肪呈极显著正相关;咖啡因与蔗糖呈极显著负相关。其余性状间相关不显著。

综上所述，鲜果重越大，绿原酸含量越低;干豆重越大，鲜干比和种子长越大，出米率和蛋白质含量也越高;种子越长越厚，百粒重、出米率也越大，蛋白质含量也越高;出米率越高，蛋白质、脂肪含量越高;蛋白质含量越高，脂肪含量越高;咖啡因含量越高，蔗糖含量越低。

2.4主成分分析

8个农艺性状和5个品质性状的主成分分析结果（表5）显示，前4个主成分（PCI+PC2+PC3+PC4）累计贡献率为69.17%。PCI贡献率为29.17%，种子长、种子宽、种子厚、百粒重和出米率在第1主成分有较高的载荷，特征值中贡献最大的是百粒重，故第1主成分为百粒重的构成因子;PC2贡献率为16.25%，鲜果重、干豆重、脂肪、绿原酸在第2主成分有较高的载荷，特征值中贡献最大的是鲜果重，故第2主成分为鲜果重的构成因子;PC3贡献率为12.35%，蛋白质、咖啡因在第3主成分有较高的载荷，其特征向量值中蛋白质贡献最大，故第3主成分为蛋白质构成因子;PC4贡献率为10.86%，鲜干比、绿原酸在第4主成分有较高的载荷，特征向量值中鲜干比贡献最大，故第4主成分为鲜干比构成因子。可见，前4个主成分的12个性状是构成小粒种咖啡种质多样性的主要因素，也是小粒种咖啡育种中应重点考虑的性状指标。

2.5 聚类分析

基于农艺性状、品质性状差异，对60份小粒种咖啡资源进行聚类分析，结果如图1所示。在遗传距离为25.0处，60份小粒种咖啡资源分为两个大类群，第I类有53份资源，第Ⅱ类有7份资源，主要表现为鲜果重差异。第I类资源鲜果重均在2.20kg以下，第Ⅱ类资源鲜果重均在2.20kg以上。可见，小粒种咖啡种质资源的鲜果重存在明显的差异。第1类又分为2个亚类，第I-1类包括49份资源，包含了卡蒂姆和萨其姆及未知品种类型的大多数资源，主要表现为比第1-2类有较大的鲜果重和种子宽，但绿原酸含量偏低，均在15.59mg·g以下。第I-1类又分为a和b两个分支，a分支较b分支鲜果重大，绿原酸、咖啡因含量高。第1-2类有4份资源，分别是180、204、282和284，主要特点是鲜果重小，均在1.30kg以下。第Ⅱ类又分为两个亚类，第Ⅱ-1类有3份资源，分别是10、51和88;第Ⅱ-2类有4份资源，分别是55、78、93和140。第Ⅱ-2类较第Ⅱ-1类具有更高的鲜果重和干豆重，鲜果重均在2.60kg以上，干豆重均在538.00g以上。综上所述，第Ⅱ类鲜果重大，尤其是II-2类，可作为选育和改良品种的基本材料。

3讨论与结论

遗传多样性是生物多样性的基础，生物遗传变异均发生在分子水平，在不断进化过程中形成了丰富的遗传多样性。种质资源遗传差异大小直接影响性状遗传改良和研究利用的效果，优异基因能否被发掘与有效利用影响着新品种选育或新材料创制。目前，我国云南和海南等地已开展对咖啡种质资源的收集保存，周华等的研究结果表明了不同咖啡种质资源之间存在丰富的遗传多样性，闫林等、黄丽芳等、王晓阳等的研究结果也表明小粒种咖啡遺传关系较紧密，但从农艺性状和品质性状方面进行种质资源遗传多样性分析还未见报道。变异系数反映了某性状数据的离散程度，其大小与性状的变异范围呈正相关，变异系数越大，表明性状的变异程度越大。本研究对60份小粒种咖啡种质资源的8个农艺性状和5个品质性状进行分析比较，鲜干比、鲜果重、干豆重、绿原酸的离散程度大，稳定性差，具有较好的遗传改良基础;出米率和蛋白质的离散程度较小，性状表现较为稳定。遗传多样性信息指数是评价种质资源的主要指标之一，值越高，表明某性状的多样性越丰富。本研究中平均遗传多样性指数1.82，其中种子长（2.04）、绿原酸（2.07）、脂肪（2.06）、蛋白质（2.05）遗传多样性指数较大，鲜干比（1.43）和蔗糖（0.55）较小。不同咖啡种质间的性状差异较大，表现出丰富的遗传多样性，且改良潜力大。

主成分分析是将多个变量转化为少数几个综合因子，每个主成分基本上又能反映原始变量的大部分信息，其所含信息互不重复。本研究的前4个主成分提供了原性状69.17%的信息，反映了所有表型性状的大部分相关信息。种子厚、百粒重、鲜果重、鲜干比、蛋白质对咖啡性状多样性构成起主要作用，可见咖啡种质资源的分类受到多个性状的共同影响。这些性状不仅可作为咖啡种质鉴定评价的重要性状，也可作为区分咖啡种质资源的主要性状。前4个主成分间包含的性状信息具有一定的相关性，且各性状类型差异较大，各主成分性状载荷值反映了主要性状的育种选择潜力。综上所述，在育种工作中，抓住种子厚、百粒重、鲜果重、鲜干比、蛋白质等主要因子，可望缩短选育新品种或新品系的年限。

农艺性状大多受多基因控制，不同性状间存在不同程度的相关性，某一性状的改变会导致其他相关性状发生变化，因此在育种过程中改良重要性状的同时可同步改良次要性状。本研究发现，种子长和种子厚与百粒重、出米率、蛋白质均呈极显著正相关，分别与蔗糖和脂肪呈显著正相关;出米率与蛋白质、脂肪呈极显著正相关;咖啡因与蔗糖呈极显著负相关。说明在咖啡品种选育过程中，通过筛选种子长和厚的种质作为亲本材料，可增加百粒重、出米率、蛋白质、蔗糖和脂肪等产量性状和品质性状;筛选咖啡因含量低的种质作为亲本材料，可增加咖啡蔗糖含量，提升品质。

本研究利用聚类分析法对60份咖啡种质的13个性状进行了聚类分析，让性状相近的聚为一类，使其同质化程度最高。每个组群具有特定的形态特征，以便更系统地分析咖啡种质资源的特点。第I类为单株鲜果重小的资源材料，这类材料具有较小的鲜果重和种子宽，绿原酸含量偏低等特点。第Ⅱ类的鲜果重大，具有较大的鲜果重和种子宽，但绿原酸含量偏低。可见，小粒种咖啡种质资源的鲜果重存在明显的差异，尤其是Ⅱ-2类的4份种质，鲜果重和干豆重最大，可作为新品种选育和改良的基本材料。

60份咖啡种质资源存在丰富的遗传多样性，可通过引种驯化、杂交、嫁接和分子育种等技术把其优异基因延续下去。针对现有咖啡种质资源具有丰富的农艺性状和品质性状多样性等特征，今后应在现有研究的基础上，结合全基因组测序和代谢组学等方法，对各表型性状进行精准鉴定、关联分析，挖掘重要性状优异基因，并与常规育种方法相结合，加快我国咖啡种质资源的创新利用和新品种选育进程。