杂交水稻骨干亲本Wx基因第一内含子+1位碱基多态性分析

连玲 潘丽燕 朱永生 许惠滨 郑燕梅 何炜 罗曦 王颖妲 蔡秋华 谢华安 张建福

摘要：[目的]直链淀粉含量是影响稻米品质的重要因素，而编码颗粒结合型淀粉合成酶（granule-boundstarchsynthetase，GBSS）的蜡质基因（Wx）是影响直链淀粉含量的主效基因。本研究拟分析120份杂交水稻亲本的Wx基因第一内含子+1位碱基的多态性，以期研究其对内含子的剪接效率及Wx的表达的影响，为亲本育种筛选提供理论参考。[方法]选取120份水稻亲本材料，采用CTAB法提取基因组DNA，并以此为模版PCR扩增Wx基因片段;采用限制性内切酶AccI对PCR产物进行酶切分析，根据琼脂糖电泳结果分析Wx基因第一内含子+1位碱基类型;同时测定其中19份亲本的直链淀粉含量、胶稠度和碱消值。[结果]PCR扩增结果显示所有材料中均可扩增出清晰且单一的目的条带;PCR产物的AccI酶切分析结果显示，其中81份亲本的Wx基因第一内含子+1位碱基是T，即为T型，占总数的67.5%，38份亲本为G型，占总数的31.67%，而仅有1份亲本为杂合型，即GT型，占总数的0.83%。19份亲本的直链淀粉含量测定结果表明，7份G型亲本的直链淀粉含量比12份T型亲本的高，且其中6个G型亲本的直链淀粉含量平均值均超过20%。另外，测定结果表明T型亲本和G型亲本的胶稠度和碱消值差别不明显。[结论]120份杂交水稻骨干亲本的Wx基因第一内含子+1位碱基类型测定结果表明，与T型亲本相比，G型亲本的直链淀粉含量明显较高，而胶稠度和碱消值没有明显差别。

关键词：Wx基因;第一内含子;碱基多态性;直链淀粉含量

中图分类号：S511文献标志码：A 文章编号：1008-0384（2019）12-1355-09

0 引言

[研究意义]随着人们对稻米品质要求的提高，水稻育种在注重提高产量的同时也越来越重视稻米品质的改良。直链淀粉含量是稻米食用和蒸煮加工品质的重要影响因素，稻米中直链淀粉含量高使得米饭硬、口感差，而其含量太低则导致米饭太软黏结，口感也不好，因此适中的直链淀粉含量是优质米的重要指标。稻米中直链淀粉含量主要由Wx基因编码的颗粒结合型淀粉合成酶（GBSS）所决定，而Wx的表达量与该基因第一内含子+1位碱基类型直接相关。因此，对Wx基因序列进行相关分析可为提高稻米品质育种效率提供必要的理论参考。

[前人研究进展]Wx基因位于6号染色体，Wang等克隆获得了水稻Wx基因，全长5499bp，包括5’及3'非翻译区、13个内含子和14个外显子;蛋白编码区CDS全长1830bp，编码609个氨基酸。Wx基因的表達与直链淀粉含量密切相关，将反义Wx基因导入籼稻保持系冈4B和II-32B，结果显示纯合转基因成熟种子中直链淀粉含量均有不同程度降低;陈刚等将反义Wx基因导入武运粳7号，发现转基因植株颖果中Wx蛋白减少，颗粒结合型淀粉合成酶活性明显下降，直链淀粉含量下降，总淀粉含量也显著降低。研究表明Wx基因的第一内含子剪切效率与第一内含子+1的碱基直接相关，当Wx基因第一内含子+1位碱基为G时，即为等位基因Wx，能够正常剪接，产生较多大小为2.3kb的Wx基因成熟mRNA进而翻译成Wx蛋白，即GBSS，从而使得稻米中直链淀粉含量较高;而当Wx基因第一内含子+1位碱基为T时，即为等位基因Wx，无法正常剪接，产生保留1kb第一内含子的大小为3.3kb的mRNA前体，Wx蛋白翻译受阻，GBSS量少，使得稻米中直链淀粉含量较低。对于Wx基因第一内含子+1位碱基类型的鉴定，研究发现当Wx基因第一内含子+1位碱基是G时，它与前后的碱基构成限制性内切酶AceI的识别位点，使相应的扩增片段能被AceI酶切;而当Wx基因第一内含子+1位碱基是T时，相应的扩增片段不能被AceI酶切。因此可以对相应片段进行扩增并采用Ace I酶切后，通过电泳条带判断出Wx基因第一内含子+1位碱基类型。另外，研究发现Wx基因序列中第一内含子剪切位点上游55bp处有（CT）n微卫星序列即串联重复序列，对不同品种的相关序列进行分析，已发现的（CT）n包括（CT）20、（CT）19、（CT）18、（CT）17、（CT）14、（CT）13、（CT）11、（CT）10和（CT）8，（CT）n的多态性与直链淀粉含量直接相关;一般高直链淀粉含量品种含有（CT）重复次数少，即n≤14的Wx等位基因，低或中等直链淀粉含量品种含有重复次数较多，即n≥16的Wx等位基因，同时在（CT）n下游182bp处存在同样与直链淀粉含量相关的（AATT）n重复序列，含有（AATT）6等位基因的品种直链淀粉含量较高，而含有重复次数少的（AATT）5等位基因的品种直链淀粉含量较低，但是这2个串联重复序列的直接功能还不太清楚。[本研究切人点]虽然蔡秀玲等采用PCR-AccI分子标记检测法检测了63个栽培品种Wx基因第一内含子+l位碱基类型，但目前仍有许多品种的Wx基因第一内含子+1位碱基类型有待进一步分析，尤其是生产上常用亲本材料。分析应用于育种的水稻亲本材料的Wx基因第一内含子+1位碱基，可为相关育种提供理论依据。[拟解决的关键问题]本研究对120份水稻亲本材料的Wx基因第一内含子+1位碱基进行分析，分析获得120份亲本材料的Wx基因第一内含子+1位碱基类型，测定其中部分材料的直链淀粉含量、胶稠度和碱消值，并分析与Wx基因第一内含子+1位碱基类型的相关性，为水稻高品质育种提供参考。

1材料与方法

1.1试验材料及试剂

120份亲本种子，由福建省农业科学院水稻研究所、农业部华南杂交水稻种质创新与分子育种重点实验室保存。室内浸种、催芽，生长一周后取整植株，用于提取基因组DNA。

rTaq DNA聚合酶和Ace I限制性内切酶均购自TaKaRa公司。

1.2 试验方法

1.2.1基因组DNA的提取采用CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）法提取基因组DNA，具体步骤如下：取0.1g左右的水稻植株装进2mL eppendorf管中，在液氮中迅速磨成粉末状;加入800uL 65℃预热的CTAB提取缓冲液，65℃温浴30min（隔5min左右翻动1次，使样品受热均匀）;取出2mLeppendorf管，冷却后加入800ul氯仿：异戊醇（24：1），混匀后10000r-min离心10min，取出后吸取上清至新的1.5mL eppendorf管中;加入2/3上清体积的冰异丙醇，混匀后置-20℃冰箱中静置30mm.;10000r·min离心5min，弃去上清;加入500ul75%的乙醇洗涤2次，置超净工作台吹干;加入200uL TE buffer（或无菌双蒸水），溶解DNA。上述提取的DNA保存于-20℃，备用。

1.2.2PCR扩增PCR扩增所用上游引物Wx F 5’CTTTGTCTATCTCAAGACAC 3’，下游引物Wx R5’TTTCCAGCCCAACACCTTAC 3。

以上述提取的DNA为模板进行PCR扩增，每个样品做3次重复，反应体系为：rTaq Buffer l uL，dNTP（2.5mmol·L）0.8uL，上游引物WxF（10umol-L）0.4uL，下游引物WxR（10pmol'L）0.4uL，DNA模板1uL，rTaq 0.1uL，ddHO补足至10uL。PCR扩增程序为：94℃预变性5min后，94℃ 30s，62℃ 30s，72℃30s，30个循环，72℃延伸7min。反应完成后，取4uL PCR产物用0.8%琼脂糖凝胶电泳进行检测。为了进一步验证试验的准确性，选其中7个样品送测序，进行序列分析。

1.2.3AccI酶切分析取上述PCR产物，进一步进行酶切分析，反应体系为：10×M buffer 1uL，PCR产物3uL，Acc 10.5uL，ddHO补足至10uL，37℃酶切5h;取5uL酶切产物用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测。

1.2.4米质分析从120份亲本材料中随机选取19份材料，种植于福建省三明市沙县夏茂基地。收获成熟种子，自然晒干，每个品种称取200g，采用中华人民共和国农业农村部标准米质测定方法NY/T83-2017，对样品的直链淀粉含量、胶稠度和碱消值进行测定，每个品种测3次重复。

2 结果与分析

2.1 PCR扩增结果

以基因组DNA为模版进行PCR扩增，琼脂糖电泳结果显示，样品中均可扩增出清晰且单一的目的条带（图1-A），所扩增出的Wx基因片段大小为253bp（图1-B），矩形框所示为Wx基因第一内含子+1位，即碱基出现多态的位点。

2.2AccI酶切结果

采用限制性内切酶AccI对PCR产物进行酶切，琼脂糖电泳结果表明酶切后出现3种带型，第一种是只有约120bp的1条带（图2-A第一泳道），即Wx基因第一内含子+1位碱基为G时，形成限制性内切酶Ace I识别位点_QTATAC（图2-B），253bp的Wx基因片段均被切成126bp和127bp 2个片段，由于这2个片段大小只差1个碱基所以电泳显示在同一个位置，这种类型记为G型。第二种还是253bp一条带（图2-A第三泳道），与图1-A显示的条带相同，即Wx基因第一内含子+1位碱基为T时（图2-B），253bp的Wx基因片段无法被AccI酶切，这种类型记为T型。第三种是出现2条带（图2-A第二泳道），一条为没有被AccI酶切动的253bp的条带，一条为被AccI酶切动后呈120bp左右的一条带，包含第一种和第二种2种带型，即为杂合型，记为GT型。

2.3120份亲本的Wx基因第一内含子+1位碱基类型分析

以本课题保存的120份水稻亲本为材料，提取基因组DNA，进行PCR扩增Wx基因片段，并用限制性内切酶AceI进行酶切分析，琼脂糖电泳结果显示了120份亲本的条带类型（图3）。根据2.2中的分类，对120份亲本的Wx基因第一内含子+1位碱基类型进行分析（表1）。结果表明，120份亲本材料中，81份为T型，占总数的67.5%，其中5个品种少蘗粳、空育131、台农67、09NB352越光、台湾粳稻为粳稻品种，其余为籼稻品种;38份为G型，占总数的31.67%，其中云引为粳稻，特青为籼偏粳，其余为籼稻品种;一个品种内江P164为GT型，占总数的0.83%。另外，将其中7个品种的PCR产物进行回收并送测序;序列分析结果显示明恢86、明恢63、多系1号和闽恢3301的Wx基因第一内含子+1位碱基为T，功米3号、南恢397、广恢128的Wx基因第一内含子+1位碱基为G（图4），与酶切分析结果一致。

2.4 直链淀粉含量、胶稠度和碱消值与Wx基因第一内含子+1位碱基类型的相关分析

从120个亲本中随机选取19个亲本，均为籼稻（特青为籼偏粳），其中12个亲本的Wx基因第一内含子+1位碱基类型为T型，其余7个亲本的为G型。对19个亲本的直链淀粉含量、胶稠度和碱消值进行测定，结果表明，Wx基因第一内含子+1位碱基类型为G型7个亲本的直链淀粉含量比碱基类型为T型亲本高;除了IR661的直链淀粉含量平均值为16.91%，其他6个G型亲本的直链淀粉的含量平均值均超过20%，Nerica2品种的直链淀粉含量最高，平均值达到26.84%;而Wx基因第一内含子+1位碱基類型为T型的直链淀粉含量平均值均在20%以下，最高的为16.67%，而最低的为9.98%;对T型组和G型组亲本的直链淀粉含量进行方差分析，差异极显著。胶稠度的测定结果显示，总体上看，Wx基因第一内含子+1位碱基类型为G型亲本的胶稠度偏高一些，但T型组和G型组亲本的胶稠度没有显著差异。另外，碱消值的测定结果显示T型组和G型组亲本之间并没有存在明显的规律性差别，方差分析显示没有显著差异（表2）。以上结果表明，直链淀粉含量确实与Wx基因第一内含子+1位碱基类型存在直接的关系，即Wx蛋白的表达量与直链淀粉含量密切相关;而胶稠度和碱消值与其关系较小。

3讨论与结论

对于稻米中直链淀粉含量性状的改良，传统育种方法是收取成熟的种子后测定直链淀粉的含量，这种做法周期长，效率不高，而且比较容易受环境条件的影响。而分子标记辅助选择直接对基因型进行选择，在苗期即可以进行，省时省力，大大提高了育种效率。

对于Wx基因第一内含子+1位碱基的鉴定，一种是PCR-AccI法;另一种是PCR一步法，即设计的引物3’末端碱基是基因第一内含子+1位碱基且为G，当模板DNA相应位置是C时，扩增产物在琼脂糖电泳图上清晰可见，而当相应位置是A时，扩增产物在琼脂糖电泳图上条带模糊。因此，PCR一步法是根据PCR产物的电泳条带亮度来判断得出Wx基因第一内含子+l位碱基类型，这种方法虽然更快速，但是容易受PCR扩增效率的影响，比如实验过程中因操作问题使得PCR扩增效率低，这样即使相应位置是G电泳条带也可能会比较淡，所以就会影响判断结果。PCR-AccI法需要在PCR之后再进行酶切，然后再进行电泳，多了一个酶切步骤，但是不受PCR扩增效率的影响，准确率相对比较高。张士陆等采用直链淀粉含量低的亲本对057进行回交改良，利用PCR-AccI分子标记辅助选择Wx基因型，结合直链淀粉含量测定进行验证，获得了农艺性状与057相似且直链淀粉降低的稳定株系。利用PCR-AccI进行辅助选育，经回交转育将来自中等直链淀粉含量优质籼稻的Wx基因导入特青品种，选育了保持有特青主要农艺性状且直链淀粉含量下调的优质品系;进一步用改良品系与培矮64S杂交，所得到的杂交组合具结实率高等优异农艺性状且直链淀粉含量明显改善。用优质的籼稻品种D香1B对综合性状优良但品质欠佳的G46B进行品质改良，利用PCR-Acc 1分子标记辅助选择，获得了直链淀粉含量中等的品系。另外，利用PCR-Acc I分子标记辅助选择，将供体材料控制直链淀粉的Wx导入到不同恢复系中，筛选获得了直链淀粉含量适中的恢复系材料;并将改良株系与广占63S和Y58S配组，得到了农艺性状没有发生明显改变且直链淀粉含量适中的组合。充分说明了利用PCR-Acc I分子标记辅助选择是改良水稻品种直链淀粉含量的有效方法。本研究采用PCR-AccI法对120个亲本材料的Wx基因第一内含子+1位碱基进行了分析，并且PCR扩增后全部样品先进行电泳，以确保每个样品均已扩增出明显的目的条带，后再进行酶切;另外，所用引物扩增出的片段，Acc I酶切位点在片段的中间，被AccI酶切后琼脂糖电泳图上只出现较小的一条带，易与没有被切动的条带区分开，电泳效果好。

本研究对120个亲本材料的Wx基因第一内含子+1位碱基进行了分析，并测定了其中19个亲本的直链淀粉含量、胶稠度和碱消值，分析说明了直链淀粉含量与Wx基因第一内含子+1位碱基类型直接相关，可为这些亲本应用于米质改良育种提供必要的理论依据。