降胆固醇活性肽检测方法的研究进展

陈丹阳 韩涛

摘 要：综述近年来国内外胆固醇以及具有降胆固醇活性的小分子肽在体内和体外的检测方法，为研究胆固醇代谢和降胆固醇活性小分子肽的研究提供参考。

关键词：胆固醇;活性肽;作用机理;检测方法;代谢

降胆固醇肽主要是通过抑制胆固醇的合成、吸收，使其成为不溶物排出体外，或者加快胆固醇分解代谢途径来降低胆固醇在体内的含量。目前，胆固醇的检测方法很多，而研究胆固醇的检测方法是寻找和利用降胆固醇物质最基础的工作，人们得到了体内血清多项指标的检测，但体内方法普遍操作繁琐且费时费力，所以对体外检测也做了大量的相关研究，建立了相关模型检测方法。但是降胆固醇肽的作用机理，人们仍然缺乏完全的认识，资料显示[1-10]，应用不同的作用机理得到不同的模型，如胆酸盐结合剂法、模拟胆汁胶束法、3-羟基-3-甲基戊二酸单酰輔酶A还原酶（HMG-CoA还原酶）抑制剂、酰基辅酶A-胆固醇酰基转移酶（Acyl-coenzyme A-cholesterol Acyltransferase，ACAT）抑制剂、低密度脂蛋白受体（Low-density Lipoprotein，LDLR）模型、Caco-2细胞（克隆结肠腺癌细胞）模型[11-12]等。

本文根据前人推测的降胆固醇活性物质的作用机理，探讨了近年来国内外胆固醇和具有降胆固醇活性的小分子肽的检测方法，为降胆固醇活性肽检测方法的研究提供参考。

1 体内降胆固醇肽的检测方法

研究动物体内检测胆固醇的方法，可明确胆固醇的代谢途径，便于探索降胆固醇活性物质的作用机理，方便进行安全和试验效果的评价。胆固醇在体内不溶于水，需要通过主动运输与脂蛋白结合，才能进入血液和体内循环。脂蛋白常见的包括极低密度脂蛋白（VLDL）、低密度脂蛋白（LDL）、高密度脂蛋白（HDL）[13]。VLDL在肝脏内合成，是机体转运内源性甘油三酯的重要形式，当VLDL明显升高时，甘油三酯（TG）也相应升高，胆固醇含量增加，但VLDL在体内含量较少且主要是影响TG的转运，故对胆固醇的影响不大;LDL是将肝脏合成的胆固醇转运到全身组织的主要形式，胆固醇含量最高，故LDL增高时，血液中胆固醇总量必然增高;HDL颗粒较小，蛋白质含量最高，能比较自由地出入动脉，可把动脉壁上的胆固醇逆向转运到肝脏中进行代谢后排出体外，所以HDL的减少就意味着胆固醇总量的增高。

金宗镰等[14]提出了在临床上测量降脂/胆固醇试验的7个指标，包括：（1）血清总胆固醇（TC）含量。（2）血清总TG含量，TG是人体内含量最多的脂类，大多数组织器官通过其分解产物供给能量。（3）HMG-CoA还原酶活性，血清中胆固醇多来自肝脏合成，而HMG-CoA还原酶是肝细胞生物合成胆固醇过程中的主要限速酶，该步骤是胆固醇前体物质转化为胆固醇的限速点，催化生成甲羟戊酸对胆固醇的合成起调节控制作用。（4）卵磷脂胆固醇酰基转移酶（LCAT）活性，由肝脏合成，在血液中与高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）发生催化反应，形成胆固醇酯，使胆固醇排出体外或进行体内吸收转化。（5）HDL-C含量，是进行临床检查血清的检测手段，包括磷钨酸沉淀法（CPAT/MgCl2 ）、多聚阴离子（化学）遮蔽法（PPD）和胆固醇脂酶和胆固醇氧化酶等酶修饰法（PGME）[15]。（6）低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）含量，临床常用方法有Friedewald公式（测定空腹样本）、均相法（特定的生化检测试剂）、超速离心法（通过利用盐调整溶液密度分离LDL）、电泳法、沉淀法、免疫分离法（抗体特异性吸附除LCL外的微粒）[16]。（7）动脉粥样硬化指数（AI），包括TC-HDL-C/HDL-C 或 LDL-C/HDL-C，其升高意味着血液内LDL浓度增高，而HDL相对比例下降，患动脉粥样硬化危险增加。

据此推断，一个降胆固醇作用的功能性肽，应能降低血清中TC和TG含量，降低AI，提高LCAT活性，增加HDL含量，降低LDL含量，或是HMG-CoA还原酶抑制剂。

选择体内检测方法，一般采用动物实验的方法，建造模拟高脂模型，而后连续灌喂试验品数周，观察各项指标的变化，在此基础上再进行人体试食实验，进行综合评价。Hori 等[17]曾进行过大豆水解物的人体试食实验，受试者试食大豆水解物或酪蛋白水解物（空白对照），研究包括为期2周的预喂养期和3个月的喂养期;3个月后，受试者血清TC明显下降，LDL-C显著降低，LDL-C/HDL-C（AI）也显著降低;但试食实验方法需要较为复杂的前处理和长时间喂养。姚余祥等[18]对大鼠进行试食实验，高脂大鼠一组喂食鹰嘴豆多肽，另一组喂食等量蒸馏水（空白对照），数周后，喂食鹰嘴豆多肽可降低高脂大鼠TC含量（22.39%），实验中没有做LCAT活性、HDL-C含量、LDL-C含量、HMG-CoA还原酶活性等的测定。白利峰等[19]研究表明，扇贝边多肽提取物具有降低TC、TG、LDL-C的作用，有助于加速胆固醇逆向转运，促进胆固醇的肝脏代谢，从而增加胆固醇的体外排出。欧成坤等[20]在小鼠实验中检测血清中的TG、TC、HDL-C、LDL-C的含量，证明了牡蛎多肽降胆固醇的能力。在紫菜多肽、醋粉、益生乳酸菌、大豆多肽[21-26]研究中均采用动物实验，建立高胆固醇组模型检测血清中7个指标，结果均有降胆固醇功效。由于HMG-CoA还原酶是肝细胞生物合成胆固醇过程中的主要限速酶，其活性的体外检测是评定降胆固醇活性肽的重要方法;方法中需要体外提取HMG-CoA还原酶测量活性和纯度，此操作有一定难度且提纯纯度不高，目前还没有找到方便快捷的解决办法;测定HMG-CoA还原酶抑制活性有分光光度计法、碳元素标记法、小鼠喂食法、HPLC法4种方法，其中HPLC原理与分光光度计法一样，HMG-CoA还原酶与底物NADPH反应，底物反应量减少，计算HMG-CoA还原酶的抑制率，但反应体系微小，容易产生误差。于刚等[27]建立了HPLC测定HMG-CoA还原酶活性的方法，NADPH浓度与峰面积呈良好的线性关系，回收率高，灵敏度高，检出限极低，方法准确度高，但实用性较低，需要较为复杂的前处理。Pak 等[28]在胃蛋白酶水解的大豆球蛋白中发现具有 HMG-CoA 还原酶抑制活性的降胆固醇活性肽，测定其分子量为755.2 Da，氨基酸序列为Ile-Ala-Val-Pro-Gly-Glu-Val-Ala，重复性较高，特异性强。梁婧婧等[29-33]在甘薯糖蛋白降胆固醇研究中，以大鼠为材料，测定血清TC、血清总TG、HDL-C、LDL-C、载脂蛋白A、载脂蛋白B、LCAT活性，并测定肝脏匀浆液HMG-CoA还原酶的活性。高学飞等[34-35]采用大鼠喂食的动物模型实验研究乳清降胆固醇功效，测定了TG、TC、HDL等指标，以及肝脏NADPH，得到了降低HMG-CoA还原酶活性17.25%的乳清肽。Lin等[36]采用噬菌体技术筛选并得到人HMG-CoA还原酶抑制剂来降低人体内胆固醇，发现四肽Pro-Met-Ala-Ser有良好的HMG-CoA还原酶抑制剂效果，可能是一个先导化合物开发的降胆固醇药物，具有良好的特异性和实效性。Marques等[37]在得到豇豆蛋白质水解物之后，先通过模拟胆汁胶束溶液方法和体外模拟胃肠道消化环境，得到小于3 000Da的高降胆固醇肽，后经羟甲基戊二酰辅酶A还原酶（HMG-CoA还原酶）试验，得到高抑制剂活性的五肽Gly-Cys-Thr-Leu-Asn，该研究体外检测和HMG-CoA还原酶方法并行，前期减少了筛选时间，实用性较高;后期方法增强了测定结果的准确性和精密性，且验证了五肽的降胆固醇的原理。

胆固醇酯化是影响血液中胆固醇水平的又一重要因素，该途径中起主要作用的有2种酶，即LCAT和ACAT。肠肝循环是机体对内源性胆固醇重吸收的必经过程，对血液胆固醇水平有重要影响。胆固醇经7α-羟化酶（Cholesterol 7 α-hydroxylase，CYP7A1）经多步反应生成初级胆汁酸，CYP7A1在此反应过程中是限速酶，故CYP7AI基因表达量的增加或酶活性增大都会促进胆固醇转化为胆汁酸而排出体外，从而减少体内胆固醇的积累[38]。武金霞等[39]利用CYP7A1基因表达产物量的变化，验证蚯蚓冻干粉降胆固醇的机理。Caco-2细胞模型可模拟小肠细胞的吸收和转运机制，可研究多肽的肠道代谢，具有良好的线性结果和准确性。Nagaoka等[40]采用Caco-2細胞模型及高脂动物模型研究了乳源肽影响胆固醇吸收的机理。五肽Ile-Ile-Ala-Glu-Lys可降低体内胆固醇含量。但动物模型用时较长。使用细胞模型的方法，拥有体内方法易于研究降胆固醇肽的作用机理、代谢途径，打破了体内培养方法时间长，影响因素复杂的壁垒，但该方法复杂且稳定性、重复性较差，价格相对昂贵，需要寻找相对便捷的方法。

体内检测方法可研究多肽降胆固醇作用，方法较为成熟，准确度高，但耗时较长，且花费较高，需要较为苛刻的检测条件，费人费力且不够便捷。在功能的体内研究前，通常先采用体外方法进行初步检测筛选。

2 体外降胆固醇肽的检测方法

根据推测的作用机理，确立了体外模型中检测胆固醇和胆酸盐含量的变化，可简单直观地显示出降胆固醇能力，特点是快速、高效、成本低，适用于动物体内实验之前。

2.1 体外胆酸盐螯合的降胆固醇检测方法

方法的原理是通过小肽结合胆酸盐以降低肠道对胆固醇的吸收。人体中约1/2的胆固醇是通过合成胆汁酸而被代谢分解的[12]，如果小肽可在小肠内与胆酸结合，形成不溶性化合物，就可阻止胆汁酸的重吸收;另外，由于胆汁酸的合成是以胆固醇为底物，若胆汁酸能被更多的排出体外，就能使血液中更多的胆固醇代谢为胆汁酸来维持正常的消化吸收，从而降低血液中胆固醇水平。胆汁酸分为两类[12]：初级胆汁酸和次级胆汁酸。常见的有胆酸、鹅脱氧胆酸、牛磺胆酸、甘氨鹅脱氧胆酸，后两种是与钠离子或钾离子结合存在。考来烯胺散剂是目前临床用来治疗这类高胆固醇血症的治疗手段，主要成分考来烯胺是阴离子交换树脂类胆汁酸盐结合剂的一种[41]，在肠道中与胆汁酸结合成不溶物，使胆汁酸不可利用于重吸收，随后被排除体外;但考来烯胺抑制了某些维生素在胃中的吸收，有时会出现恶心、呕吐、便秘等症状。

胆酸盐体外检测方法一般分为紫外分光光度法和高效液相色谱法。紫外分光光度法分为比色硫酸法和糠醛比色法。比色硫酸法是胆酸盐分子与硫酸反应后形成酚类，经过比色后在377～390nm会出现特征吸收峰，测得胆酸盐含量。江锟等[42]通过胰蛋白酶酶解鲈鱼蛋白制备高活性的降胆固醇肽，利用硫酸比色法测定其降胆固醇能力，分离纯化后得到小于1 400 Da的小肽组分，方法重现性好，准确度好和干扰较少，特异性较好，但检出限较高，精密度较差。糠醛比色法是糠醛分子的羧基在浓硫酸催化下与胆汁酸分子的羟基发生缩合反应，对反应物质进行紫外扫描时，胆汁酸分子在550～620nm的范围内产生明显的特征吸收峰，可进行胆汁酸盐含量测定。许多研究采用此方法进行胆酸盐含量检测，操作简单可行，不需要大型仪器，快捷高效，但稳定性和重现性与比色硫酸法比稍差。周小理等[43]在苦荞的体外胆酸盐研究中利用糠醛比色法，建立了胆酸盐的标准曲线，拟合度较高，在较宽的浓度范围内具有良好的线性关系，并以胆酸钠、脱氧胆酸钠和牛磺胆酸钠为材料，证实了苦荞有结合胆酸盐能力，苦荞的有效成分具有降胆固醇的作用。此方法后经黄昆[44]在山杏仁制备降胆固醇肽中证实可行。宋玲钰等[2]采用糠醛比色法制备花生降胆固醇肽，并将其应用于饮料开发中。刘珊珊等[45]使用糠醛比色法测人工牛黄中的胆酸含量，发现测定的糠醛比色法结果偏高，在样品比色过程中增设一个糠醛空白，可消除糠醛和硫酸反应生成的干扰，抗干扰能力大大加强，改进后结果更加直观准确且可靠，方法简便，可定性测量，回收率高，但不能进行定量测量，故现在的方法均加有糠醛空白对照。

高效液相色谱法被广泛应用于胆固醇含量的测定，灵敏度高、准确度高、检出限低、具有较高的稳定性，不仅可进行定性测定，还可做含量较低的定量检测;HPLC法重现性好但试验材料前处理复杂，时间稍长，方法在2016年纳入国标中[46]（GB 5009.128—2016 食品安全国家标准食品中胆固醇的测定）。李贵兴等[47]利用RP-HPLC 测定血清中胆汁酸含量，结果表明，该方法在胆汁酸浓度100μmol/L内时具有良好的线性范围，准确度高，精密性良好，最低检出限约为3μmol/L。Lee等[48]釆用RP-HPLC和毛细管电泳的方法测量血清样品中的胆汁酸浓度，比较了两种方法测定胆汁酸含量差异，发现两种方法均可靠可行，RP-HPLC方法检出限更低，灵敏度更高，但普通定量检测毛细管电泳方法时间短，价格低，故两种方法结合使用，都可用来研究血清中胆固醇的变化。

2.2 体外模拟胆汁胶束溶液的降胆固醇检测方法

方法的原理是胆固醇进入人体胃肠道后，在胆盐的乳化作用下与其他脂类混合形成胶束溶液，而胆固醇只有溶于混合胶束，才会被运至小肠绒毛进行吸收，因此，使胆固醇溶于胶束溶液是胆固醇吸收的关键。体外模拟的人体肠道，用高速或者超声波乳化的方法制备出一种人造的胆汁胶束溶液。多肽能降低胆固醇在油相和胶束相中的溶解度，与胆固醇竞争进入胶束溶液，竞争混合胶束的空间并取代胆固醇，使胆固醇不能溶于胶束溶液，干扰其吸收，可初步测定其降胆固醇的能力[49-50]。

体外模拟胆汁胶束溶液检测方法已沿用40年，由Nagaoka第一次报道，该方法关键在于胶束溶液的制备以及通过超高速离心破坏胶束溶液得到未被乳化的胆固醇，测定抑制率。根据Nagaoka[40，51]方法，胶束溶液体系中含有10 mmol/L牛磺胆酸钠溶液、2 mmol/L胆固醇、5 mmol/L油酸、pH为7.4的15mmol/L的磷酸缓冲液、132 mmol/L NaCl溶液、5g/L的蛋白水解物，混匀后将混合物高速或者超声乳化;将混合物在37℃下培养24 h后超速离心16 000r/min 60min，取上清测定胆固醇含量。他们将乳球蛋白通过胰蛋白酶水解，利用胆汁胶束溶液方法测定其降胆固醇能力，最后从中分离纯化得到了降血脂多肽段Ile-Ile-Ala-Glu-Lys[52]，为后人检测降胆固醇肽提供方法。

王才立等[53]运用邻苯二甲醛比色法对制备的小麦胚芽肽进行了降胆固醇活性的测定，结果表明，分子量越低，对胆固醇抑制作用越明显，方法简单易行，重现性好，但模拟胶束溶液时间较长，需要恒温恒湿振荡过夜。刘恩岐等[54-55]利用大孔吸附树脂乙醇分级洗脱的方法分离纯化黑豆肽，利用胆汁胶束溶液-硫酸铁比色方法测定降胆固醇活性，得到降胆固醇肽中都含有Pro且位于N端之外的位点上的结论，方法操作较为简单，且准确度较高，但不能进行微量检测，检测成本低。庄建鹏等[56]利用大孔吸附树脂乙醇分级洗脱的方法分离纯化乳清蛋白肽，利用胆汁胶束溶液方法测定降胆固醇活性，优化了胶束溶液的配制方法，相对灵敏度较高，线性良好。蒋琛等[57]、姚余祥等[58]分别以乳清和鹰嘴豆为原料，酶解制备降胆固醇肽，利用胆汁胶束溶液方法测定降胆固醇活性，得到胆固醇抑制率18.21%的乳清蛋白肽和71.55%的鹰嘴豆肽，验证了胆汁胶束溶液方法具有较高的准确度、灵敏度和回收率，检测限与胆酸盐螯合方法相比较低。郑睿等[59]在制备亚麻籽降胆固醇肽时采用胆汁胶束溶液方法，通过比色方法验证其降胆固醇的能力以及通过GC-MS得到降胆固醇肽链结构一般为Pro含量高、疏水氨基酸比例含量高、N末端为Arg等结论。Zhong等[60]采用体外模拟胆汁胶束方法进行了大豆降胆固醇活性肽的分离纯化，得到了具有显著降低胆固醇活性肽组分 Try-Gly-Ala-Pro- Ser-Leu。Pedroche等[61]通过体外模拟胆汁胶束方法，从埃塞俄比亚芥菜中也得到了分子量在1 400～1 800 Da之间的具有显著降低胆固醇活性小肽。Lin 等[62]在文蛤的内脏肌肉部分（包括内脏）得到具有较高的胆汁酸结合能力和较大的体外胆固醇胶束溶解度的降胆固醇小肽（Val- Lys-Pro和Val-Lys-Lys）。Francisco等[63]在油麻藤肽对胆固醇胶束溶解度的抑制率时发现，油麻藤肽的抑制率在0.24%～0.47%之间，表明肽的生物活性的因素由其疏水性、大小和氨基酸序列决定。

3 展望

对天然蛋白源的降胆固醇活性肽的研究在逐步开展，检测限速酶活性或者检测基因表达量是今后研究的方向。试验技术的不断发展，将会进一步提高方法的可靠性、准确性、精密性，缩短时间，减少费用。

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Abstract：Research progress in the detection methods of cholesterol metabolism and hypocholesterolemic peptides，in vivo or in vitro，was reviewed to provide scientific reference for research on cholesterol metabolism and hypocholesterolemic peptides.

Keywords：cholesterol;peptide;mechanism of action;detection method;metabolism

（责任编辑 唐建敏）