Daxx基因在小鼠睾丸精子发生过程中的表达分析

周生辉

[摘要]目的：分析Daxx基因在小鼠睾丸精子发生过程中的表达。方法：对不同周龄的野生小鼠的睾丸组织、成年睾丸支持细胞的雄激素受体特异性敲除（SCARKO）以及其雄性激素受体的敲除（ARKO）小鼠睾丸的水平进行检测分析。结果：SCARKO小鼠和野生型的小鼠相比较其睾丸中Daxx基因的表达没有明显不同，然而在生精细胞的细胞核当中呈现极性分布的情况，在ARKO小鼠的睾丸Daxx基因的表达与其他方法相比明显降低。结论：ARKO的小鼠与野生型小鼠相比其Daxx基因的表达明显降低，Daxx基因的定位情况受到睾丸支持细胞中AR基因的特异性敲除的作用。小鼠睾丸精子的发生过程可能有Daxx基因的参与。

[关键词]Daxx基因;实验小鼠;睾丸;精子

[中图分类号]R321 [文献标识码]A [文章编号]2096-5249（2019）21-0011-02

在精子的发生过程中雄激素以及受体（AR）有及其重要的影响Ⅲ。精子不能正常发挥作用以及男性造成的不育状况与雄激素的低水平或AR基因突变情况有直接关系，睾丸的组织不相同细胞类型的条件性AR基因敲除以至于小鼠呈现各种情况的生精障碍。睾丸支持细胞中的AR调节精子的发生受到雄激素作用的影响。相关研究人员通过使用二代测序的方法，对SCARKO小鼠和野生型的小鼠睾丸的表达进行详细的对比，结果发现存在一系列的基因差异表达情况。对于AR敲除后的死亡结构域的相关蛋白其表达显著降低。Daxx基因最终能够进入细胞核，而后进入细胞质最终使细胞凋亡。Daxx蛋白表现出来的高表达情况说明其影响睾丸的生精作用，值得对睾丸生理方面的深入探究。

1资料和方法

1.1材料的准备准备1、2、3、4、6、8周的野生型小鼠各4只，经处死后将其睾丸的总RNA提取出来。8周的小鼠、ARKO和SCARKO小鼠各准备4只，取其膀胱、脾、心、肾、肝、肺、脑、睾丸、附睾的总RNA和总蛋白，将睾丸组织进行固定。

1.2提取反转录PCtL采用0.8%的琼脂糖电泳检验RNA完整程度。将RNA进行定量操作后取1ug并参照说明进行反转录操作。将Cdna提取后进行PCR反应，反应体系包括10uL的PCR、8uL的双蒸水、1uL的Cdna以及各0.5uL的引物，总为20uL。PCR扩增在98℃两min的预变性，98℃的10s钟的变性，60℃的30s退火，72℃的20s的延伸总计为35个循环过程，在72℃下延伸5min，在4℃下进行冷却，对扩增产物的检验采用2.5%的琼脂糖凝胶电泳检验。

1.3通过荧光定量仪对qPCR进行检验反应体系中有10uL的TaqⅡPCR，1uL的cDNA，8uL的DEPC H20，0.5uL的上下游引物。在95℃下30s，95℃下5s，60℃下30s，72℃下15s，一共为40个循环过程。内参为GAPDH。

1.4Western印迹蛋白质的浓度大小通过BCA方法进行测定，将浓度定为1微克/uL，将5倍的上样缓冲液加入其中，在98℃下进行5min。然后通过常规电泳、转膜和5%的脱脂牛奶进行封闭处理，将一抗加入经过一夜。采用TBST清洗重复3次，每次清洗5min，将二抗加入进行1小时的室温培育，清洗方法同上，ECL发光液体在培育后曝光。室温保存直至晾干然后扫描获取结果。

1.5免疫组化以及细胞免疫荧光染色将石蜡包裹的睾丸组织切成厚度为3微米的片状，并干燥后备用。一次经过二甲苯、乙醇水、枸橼酸处理，冷却达到室温，采用4%多聚甲醛固定细胞，0.1%的Trion x-100进行十min的打孔操作。精原细胞爬片之后，清洗并固定，将切片或爬片在室温下封闭保存1小时，一抗在4℃下经过一晚，1gG荧光二抗在室温下培育两小时，染核后用荧光防猝灭剂封闭样品片，观察荧光状态。采用1gG代替一抗进行阴性比较。

1.6培养细胞在5%的二氧化碳，温度为37℃的条件下培养。

1.7统计学方法用SPSS20.0对实验的所有数据进行统计分析，计量资料（x±s）表示，通过t检验进行组间比较，使用计数数据病例数（n，%），并进行x检驗。P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1不同周龄的野生型小鼠其Daxx基因在睾丸中的表达2周的小鼠Daxx基因表达处于较低水平，3周的小鼠表达升高，mRNA在其性成熟时表达水平为最高。2周的小鼠其蛋白水平表达较低，与mRNA相类似。4周达到最高，6、8周开始降低，但相差不显著。

2.2AR.KO、SCARKO小鼠与野生小鼠睾丸中Daxx基因的表达情况对比SCARKO小鼠的睾丸中mRNA与蛋白的表达水平与野生小鼠相比没有明显的不同，ARKO的小鼠mRNA与蛋白的水平明显下降。

2.3Daxx在1周和2周的荧光强度比较弱，到3周增强，4周表现最强，6、8周的荧光强度与4周相比没有明显不同。4周的生精细胞经研究表现出核极性的表达。

2.4野生型成年小鼠的Daxx的荧光强度集中于细胞核，SCARKO小鼠的荧光强度比较强，表现出细胞核极性表达情况，ARKO小鼠的荧光强度比较弱，定位无法确定。

2.5Daxx表现于精原细胞的细胞核部位。

3讨论

SCARKO和ARKO的生精过程分别在精母细胞减数分裂的细线期和粗线期停止，特异性AR敲除小鼠与野生型小鼠没有显著的不同。支持细胞中AR基因的特异性敲除和全身性的AR基因敲除有相似的阻碍精子发生的情况，精子发生也与支持细胞有重要关系。AR的主要表达部位为睾丸的支持细胞、间质细胞、血管壁以及肌样细胞。有专家发现SCARKO与野生型小鼠的睾丸在Daxx表达上有显著差异。这一系列研究为精子被阻碍造成男性不育提供临床诊疗根据。

在本次研究过程中，2、3周的小鼠Daxx基因的表达从较低变为升高，4周的小鼠为最高，6，8周的小鼠又开始下降，但与4周的相比没有明显的不同。SCARKO小鼠的睾丸中mRNA与蛋白的表达水平与野生小鼠相比没有明显的不同，ARKO的小鼠mRNA与蛋白的水平明显下降。Daxx在1周和2周的荧光强度比较弱，到3周增强，4周表现最强，6、8周的荧光强度与4周相比没有明显不同。野生型成年小鼠的Daxx的荧光强度集中于细胞核，SCARKO小鼠的荧光强度比较强，表现出细胞核极性表达情况，ARKO小鼠的荧光强度比较弱，定位无法确定。Daxx表现于精原细胞的细胞核部位。

综上所述，本次研究探究了Daxx基因在小鼠睾丸精子发生过程中的表达特点，发现小鼠睾丸精子的发生过程存在Daxx蛋白的调节和控制的参与，并深入观察了Daxx的作用，为临床上治疗男性不育症状提供诊疗依据。