腹水草水提液对胃溃疡大鼠PGE2和COX-2表达的影响

张海霞 任伟铭 祁依佳 沈贵芳 赵伟春

摘要：目的：研究腹水草Veronicastrum axillare水提液对乙醇造模胃溃疡大鼠前列腺素E2（PGE2）和COX-2表达的影响。方法：将SD大鼠随机分成6组，每组8只。正常组和模型组给予0.9%生理盐水灌胃;雷尼替丁组给予0.027 g/kg·d雷尼替丁混悬液灌胃;腹水草高、中、低剂量组分别给予2.8 g/kg·d、1.4 g/kg·d和0.7 g/kg·d腹水草水提液灌胃。连续给药14d，于最后一次灌胃后，用无水乙醇制备胃溃疡模型。采用夹心ELISA、RT-PCR和Western Blot分析腹水草水提液对大鼠胃组织PGE2含量、COX-2 mRNA和蛋白表达的影响。结果：模型组大鼠胃组织中PGE2含量、COX-2 mRNA和蛋白表达水平显著低于正常组，而腹水草水提液显著提高大鼠胃组织中PGE2含量、COX-2 mRNA和蛋白表达水平。结论：腹水草水提液通过调节COX-2表达水平，使得胃组织中PGE2的含量增加，从而保护胃黏膜。

关键词：腹水草;胃溃疡;前列腺素E2;环氧合酶2

中图分类号：R285      文献标识码：A 文章编号：1003-2177（2019）17-0123-03

胃溃疡是临床上常见、多发性疾病。全球每年有1400多万人被诊断为胃溃疡，约400万人死于相关并发症[1]。关于胃溃疡的发病机制，目前被广泛接受的是攻击因子和防御因子失衡学说[2]。胃溃疡主要攻击因子有胃酸，肿瘤坏死因数，内皮素等。主要防御因子有NO及NO合成酶，前列腺素（PGs），表皮生长因子等。PGs不在细胞中贮存，一旦机体需要，能很快通过环氧合酶（COX）反应合成。COX-2诱导的直接结果是以前列腺素E2（PGE2）为主的PGs产物的合成增加，从而保护胃黏膜。PGE2是最重要的胃黏膜保护因子之一[3]，COX是PGs合成过程中重要的限速酶。在明确腹水草水提液抗大鼠乙醇型胃溃疡的效果的基础上[4]，本文分析了腹水草水提液对PGE2及COX-2的表达的影响，为明确腹水草对抗大鼠乙醇型胃溃疡的作用途径提供理论和实践依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

SPF级SD大鼠48只，6～7周龄，体重180g～220g，雌雄各半，购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司。腹水草水提液的制备方法见沈贵芳等[4]。RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis 试剂盒（批号：00064478）。PGE2试剂盒（批号：CK-E90201R），上海源叶生物科技有限公司。COX-2兔抗鼠多抗（批号：BA0738），武汉博士德生物工程有限公司生产。β-Actin Antibody和Goat Anti-Rabbit IgG-HRP（均购自艾比玛特生物医药（上海）有限公司生产。批号分别为：214673和214575）。

1.2 分组、给药与造模

将48只大鼠按性别分层随机化分成6组，每组8只。正常组和模型组灌胃生理盐水（4mL/只）;雷尼替丁组灌胃0.18%雷尼替丁混悬液（0.027g/kg·d，0.0054g/只，临床剂量的3倍）;腹水草各剂量组分别灌胃高、中、低剂量腹水草水提液（2.8、1.4、0.7g/kg·d，4mL/只），1次/d，连续给药14d。第14d给药后1h，正常组灌胃1mL/只生理盐水，其余大鼠均灌胃1mL/只无水乙醇造模，造模前禁食自由饮水24h。

1.3 胃黏膜组织中PGE2的测定

取部分胃组织于0℃下匀浆，于4℃下20000r/min离心20min，取上清液。采用抗体夹心ELISA方法，测定胃黏膜组织中PGE2的含量。

1.4 胃黏膜组织中COX-2蛋白的测定

采用RIPA裂解液提取胃黏膜组织蛋白。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳采用10%的分离胶和5%的浓缩胶，将蛋白质转移到硝酸纤维素膜上进行Western Blot分析。以COX-2/β-actin蛋白条带的密度比值作为COX-2的相对表达量。

1.5 胃黏膜组织中COX-2 mRNA的测定

采用Trizol试剂提取胃黏膜组织总RNA，经非变性琼脂糖凝胶电泳检验RNA的完整性后按照RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis 试剂盒说明书合成cDNA第一链。COX-2的PCR扩增条件为：94℃预变性4min ;94℃变性30s;56℃退火30s;72℃延伸1min，30个循环;72℃充分延伸8min;β-actin的PCR扩增条件为：94℃预变性3min;94℃变性1min;60℃退火45s;72℃延伸1min，25个循环;72℃充分延伸10min;PCR扩增结束经琼脂糖凝胶电泳后利用凝胶成像系统进行扫描分析，以COX-2/β-actin比值表示各样本mRNA的相对含量。

1.6 数据统计分析

所有数据以均值±标准差（±S）表示，组间比较采用LSD单因素方差分析（ANOVA）。

2 结果

2.1 各组大鼠胃黏膜组织中PGE2含量的比较

结果见表1。模型组、雷尼替丁组和腹水草各剂量组大鼠胃黏膜组织PGE2含量均显著低于正常组（P <0.05，P <0.01）。与模型组相比，腹水草各剂量组、雷尼替丁组的PGE2含量均显著提高（P <0.05，P <0.01）。

2.2 各组大鼠胃黏膜组织中COX-2蛋白含量的比较

模型组、腹水草各剂量组和雷尼替丁组大鼠COX-2蛋白的表达量显著高于正常组（图1，图2）。与模型组比较，腹水草各剂量组和雷尼替丁组大鼠的COX-2蛋白水平顯著增加（P <0.01），其中腹水草高剂量组是模型组大鼠的3.9倍，是正常组大鼠的13.2倍。腹水草各剂量组大鼠的COX-2蛋白水平亦显著高于雷尼替丁组。腹水草低、中、高剂量组间的COX-2蛋白水平亦随着腹水草剂量的升高而提高（P <0.01）。

2.3 各組大鼠胃黏膜组织中COX-2 mRNA的比较

正常组大鼠胃黏膜组织内COX-2 mRNA的表达量最低，COX-2/β-actin为0.071±0.018（图3，图4）。腹水草各剂量组、雷尼替丁组和模型组COX-2 mRNA水平均显著高于正常组，其中腹水草高剂量组是正常大鼠的11.4倍（P <0.01）。雷尼替丁组、腹水草中剂量组和腹水草高剂量组的COX-2 mRNA的表达量高于模型组（P <0.01）。腹水草各剂量组间COX-2 mRNA的表达量差异不显著（P >0.05）。

3 讨论

PGE2是最重要的胃黏膜保护因子之一，但其保护胃黏膜的机制尚未阐明。一般认为，与其促进黏液及HCO3-的分泌，改善细胞内对H+的中和能力，增加表面疏水性、保护黏膜屏障、调节胃黏膜血流量等有关。已有研究表明，双蒲散提高溃疡愈合质量的机制可能是增加胃黏膜组织PGE2含量，促进黏膜修复[5]。酒速愈可通过升高胃黏膜PGE2含量，加强胃黏膜的黏液—碳酸氢盐屏障，减轻乙醇对胃黏膜的损伤[6]。腹水草具有去腐生肌和散血逐瘀的作用[4]，本实验表明，腹水草水提液通过促进胃组织中PGE2的合成及释放来保护胃黏膜。

PGE2在体内由花生四烯酸（arachidonic acid，AA）所合成。细胞膜磷脂在磷脂酶A2的作用下生成花生四烯酸，花生四烯酸在环氧合酶的作用下生成环内过氧化物前列腺素G2（PGG2）、前列腺素H2（PGH2）。PGH2很不稳定，很快转变成前列腺素E2（PGE2）和血栓素A2（TXA2）等物质。研究认为[7]，在正常大鼠胃黏膜组织中，COX-2蛋白几乎无表达，COX-2 mRNA的表达量很少;但在胃溃疡发生或溃疡愈合的过程中，COX-2蛋白大量表达，COX-2 mRNA的表达量急剧上升。本实验结果亦表明，腹水草水提液能提高COX-2 mRNA和COX-2蛋白表达量，促使胃黏膜组织中PGE2含量增加，进而调节胃粘液及黏膜血流量，保护黏膜屏障，从而抑制胃溃疡的发生。

参考文献

[1]Srikanta B M，Siddaraju M N，Dharmesh S M. A novel phenol-bound pectic polysaccharide from Decalepis hamiltonii with multi-step ulcer preventive activity. World J Gastroenterol， 2007，13（39）：5196-5207.

[2]Warren J R， Marshall B J. Unidentified curved bacilli on gastric epithelium in active chronic gastritis[J].Lancet，1983（1）：1273.

[3]沈贵芳，赵伟春，张文诗. 胃黏膜损伤防御机制的研究进展[J].世界中西医结合杂志， 2011，6（3）：257-260.

[4]沈贵芳，郭伟，赵伟春，等.腹水草对大鼠乙醇型胃溃疡的影响[J].中国中西医结合杂志，2012，32（10）：1370-1373.

[5]陈文，何晓晖，陈建章，等.双蒲散对大鼠慢性胃溃疡愈合质量及抗复发的影响[J].中国中西医结合消化杂志，2008，16（2）：84-87.

[6]杨牧祥，于文涛，胡金宽，等.酒速愈对急性酒精中毒小鼠胃黏膜TNF-α、IL-8、PGE2含量的影响[J].中华中医药学刊，2007，25（6）：1096-1098.

[7]Guo J S， Cho C H， Wang W P， et al. Expression and activities of three inducible enzymes in the healing of gastric ulcers in rats[J].World J Gastroenterol， 2003，9（8）：1767-1771.

（编辑：周安琪）

Abstract：Objective： The study was to observe the antiulcer effect of the decoction of Veronicastrum axillare on gastric ulcer in rat induced by ethanol， and the effect of V. axillare on the expression of PGE2 and COX-2.Methods： 48 SD rats were randomly divided into 6 groups. Normal group and model group were given 0.9% normal saline respectively. Ranitidine group were given 0.18% ranitidine suspension （0.027 g/kg·d）. The high dose group， medium dose group and low dose group were gavaged with 2.8g/kg·d， 1.4g/kg·d and 0.7 g/kg·d of the decoction of V. axillare for 14 consecutive days respectively. After gavaging for the last time， the gastric ulcer models were prepared by gavaged with ethanol. The rats were killed one hour later. Using the method of ELISA， RT-PCR and Western Blot， the effect of V. axillare on the expression of PGE2， COX-2 mRNA and COX-2 protein were analyzed. Results： The decoction of V.axillare significantly increased the level of PGE2 in gastric tissue of rats. They efficiently promoted the mRNA and protein expressions of COX-2（Compared with the model control group， P <0.01）. Conclusions： The decoction of V. axillare can effectively improve the expression levels of COX-2 mRNA and protein. This caused the increase of PGE2 content in gastric tissue， thereby protecting gastric mucosa and against the occurrence of ethanol-induced gastric ulcer.

Key words：Veronicastrum axillare; gastric ulcer; PGE2; COX-2