粉防己碱对神经母细胞瘤细胞增殖和迁移、侵袭能力的影响及其机制研究

邓香

中图分类号 R730.264；R965 文献标志码 A 文章编号 1001-0408（2019）02-0211-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2019.02.14

摘 要 目的：探讨粉防己碱（TET）对神经母细胞瘤细胞增殖和迁移、侵袭能力的影响及其作用机制。方法：以人神经母细胞瘤细胞系IMR-32细胞、SH-SY5Y细胞为研究对象，采用四甲基偶氮唑蓝（MTT）方法检测浓度分别为0（空白对照）、2.5、5、10、15、20 μmol/L的TET对细胞增殖的影响；采用Transwell小室迁移实验和侵袭实验，考察正常对照组（TET浓度为0 μmol/L）和TET组（10 μmol/L，IMR-32细胞；15 μmol/L，SH-SY5Y细胞）的细胞跨膜情况；采用Western blotting法檢测按上述浓度TET处理后的IMR-32细胞和SH-SY5Y细胞中金属基质蛋白酶2（MMP-2）、MMP-9、β-catenin、糖原合成激酶3β（GSK3β）、磷酸化GSK3β（p-GSK3β）的蛋白表达水平。结果：5、10、15、20 μmol/L的TET可显著降低IMR-32细胞和SH-SY5Y细胞的存活率（P<0.05或P<0.01），其半数抑制浓度分别为10.148、14.461 μmol/L。细胞迁移实验和侵袭实验结果显示，与正常对照组比较，TET组跨膜细胞数均显著减少（P<0.01）；Western blotting法检测结果显示，与正常对照组比较，TET组细胞中MMP-2、MMP-9、β-catenin、p-GSK3β蛋白表达均显著降低（P<0.01）。结论：TET对神经母细胞瘤细胞的增殖和迁移、侵袭能力具有明显的抑制作用，其机制与下调细胞中MMP-2、MMP-9蛋白表达及抑制Wnt/β-catenin信号通路有关。

关键词 粉防己碱；神经母细胞瘤；IMR-32细胞；SH-SY5Y细胞；增殖；迁移；侵袭

ABSTRACT OBJECTIVE： To investigate the effects of tetrandrine （TET） on the proliferation and migration， invasion ability of neuroblastoma cells and its mechanism. METHODS： Human neuroblastoma cell lines IMR-32 and SH-SY5Y were chosen as objects. MTT assay was used to detect the effects of 0 （blank control）， 2.5， 5， 10， 15， 20 μmol/L TET on cell proliferation. The transmembrane number of normal control group （TET concentration of 0 μmol/L） and TET group （10 μmol/L for IMR-32 cells， 15 μmol/L for SH-SY5Y cells） were investigated by Transwell cell migration and invasion experiments. The protein levels of MMP-2， MMP-9， β-catenin， GSK3β and p-GSK3β in IMR-32 cells and SH-SY5Y cells were tested by Western blotting assay after treated with TET of above concentrations. RESULTS： TET with 5， 10， 15， 20 μmol/L can reduce the survival rate of IMR-32 cells and SH-SY5Y cells significantly （P<0.05 or P<0.01）. IC50 of which to IMR-32 cells and SH-SY5Y cells were 10.148 and 14.461 μmol/L， respectively. Results of migration and invasion experiments showed that compared with normal control group， the number of transmembrane cells was decreased significantly in TET group （P<0.01）. Results of Western blotting assay showed that compared with normal control group， the protein expression levels of MMP-2，MMP-9，β-catenin and p-GSK3β were decreased significantly in TET group （P<0.01）. CONCLUSIONS： TET shows significant inhibitory effects on the proliferation， migration and invasion ability of neuroblastoma cells， the mechanism of which may be associated with down-regulating the protein expression of MMP-2 and MMP-9 and inhibiting Wnt/β-catenin signaling pathway.

KEYWORDS Tetrandrine； Neuroblastoma； IMR-32 cell； SH-SY5Y cell； Proliferation； Migration； Invasion

神经母细胞瘤（Neuroblastoma，NB）是儿童常见的恶性实体肿瘤，其起源于交感神经神经嵴，属于神经内分泌性肿瘤；由于NB具有较高的异质性，且其存在恶性程度高、生长迅速、容易转移等特点，故患者治疗效果差、预后差[1]。目前NB的治疗手段主要包括手术切除、化疗、放疗、骨髓/造血干细胞移植及生物治疗等，但一旦NB患者出现肿瘤转移，则其病死率极高[2]。

粉防己碱（Tetrandrine，TET）属于双苄基异喹啉类生物碱，是从粉防己的根块中提取出的有效成分，在治疗高血压、心律不齐、关节炎、炎症甚至矽肺等方面发挥着重要作用[3-4]；此外，其在抗肿瘤如肝癌[5]、胃癌[6]、膀胱癌[7]及肾癌[8]等方面也具有一定功效。研究表明，TET主要通过直接的细胞毒性作用、抑制细胞增殖、诱导癌细胞凋亡、保护正常组织免受放射损伤以及抗转移、抗血管再生等途径发挥较好的抗肿瘤作用，其主要作用机制可能是激活线粒体死亡通路，进而诱导肿瘤细胞凋亡[9]。但TET 用于NB治疗的相关研究报道较少。

IMR-32和SH-SY5Y细胞系来源于人NB细胞系，其在细胞形态和功能上与正常人神经细胞有较多相似之处，因而成为颅内肿瘤研究的重要细胞模型之一[10]。本研究以这类细胞系为研究对象，考察TET对NB细胞的增殖以及迁移、侵袭能力的影响，并通过检测信号通路相关蛋白水平的变化探讨TET抑制NB细胞的作用机制，以期为TET临床用于治疗NB以及探索新的NB治疗靶点提供实验依据。

1 材料

1.1 仪器

VIOS 160i型 CO2恒温培养箱（美国 Thermo Fisher Scientific公司）；Transwell小室（美国Corning公司）；细胞培养板（上海晶安生物科技有限公司）；JIDI-17R型微量高速冷冻离心机（广州吉迪仪器有限公司）；BDS200型倒置光学显微镜（北京奥特伟业光学仪器有限公司）；DG5031型酶联免疫检测仪（上海珂准仪器有限公司）；HCB1502型电子天平（英国ADAM公司）。

1.2 药品与试剂

TET对照品（批号：T2695，纯度：≥98%）、青霉素、链霉素（美国Sigma-Aldrich公司）；1640培养基、DMEM/F12培养基、胎牛血清（美国Gibco公司）；Matrigel基质胶（美国BD公司）；金属基质蛋白酶2（MMP-2）兔单抗、MMP-9兔单抗（美国Santa Cruz公司）；β-catenin兔单抗、糖原合成激酶3β（GSK3β）兔单抗、磷酸化GSK3β（p-GSK3β）兔单抗（美国CST公司）；β-actin抗体（美国Abcam公司）；辣根过氧化物酶标记抗体（二抗，北京博尔西科技有限公司）；胰酶（广州碧云天有限公司）；二甲基亚砜（DMSO）、四甲基偶氮唑蓝（MTT）（美国Sigma公司）；多聚甲醛（北京雷根生物技术有限公司）；TBST缓冲液、结晶紫（北京索莱宝科技有限公司）；化學发光（ECL）试剂、BCA试剂（美国Pierce公司）；蛋白上样缓冲液（北京普利莱基因技术有限公司）；其余试剂均为分析纯或实验室常用规格；pH 7.2磷酸缓冲盐溶液（PBS）为实验室自制；水为双蒸水。

1.3 细胞

人神经母细胞瘤细胞系IMR-32细胞、SH-SY5Y细胞（美国ATCC细胞库）。

2 方法

2.1 细胞培养

将IMR-32细胞、SH-SY5Y细胞分别培养于含10%胎牛血清、100 μg/mL青霉素、100 μg/mL链霉素的1640培养基或DMEM/F12培养基（以下各试/实验步骤相同），在37 ℃、5% CO2培养箱中培养。细胞每隔2～3 d进行换液，待细胞生长至80%～90%融合度时使用胰酶进行消化传代培养。

2.2 TET对NB细胞的毒性作用考察

采用MTT法进行检测。取对数生长期的IMR-32细胞和SH-SY5Y细胞，按8 000个/孔接种于96孔板。待细胞贴壁生长后吸弃培养基，加入终浓度分别为0（空白对照）、2.5、5、10、15、20 μmol/L 的TET甲醇溶液，每种浓度设置5个复孔。将细胞置于37 ℃、5%CO2培养箱培养24 h；吸弃上清液，分别加入含1 mg/mL MTT的培养基200 μL，继续培养3 h；培养完毕后吸弃上清液，加入DMSO 150 μL，置于振荡器上振荡10 min。采用酶联免疫检测仪在490 nm波长处检测细胞光密度（OD）值，计算细胞存活率。细胞存活率（%）=（OD试验组/OD空白对照组）×100%。

2.3 TET对NB细胞迁移、侵袭能力的影响考察

2.3.1 NB细胞迁移实验 取对数生长期的IMR-32细胞和SH-SY5Y细胞并分为正常对照组、TET组，经胰酶消化，无血清培养基重悬细胞并计数，调整细胞密度为1.0×105个/mL。在Transwell上室加入细胞悬液200 μL，然后根据TET细胞毒性考察结果分别加入终浓度为0 μmol/L（正常对照组）、10 μmol/L（IMR-32细胞，TET组）或15 μmol/L（SH-SY5Y细胞，TET组）的TET甲醇溶液；下室加入含10%胎牛血清的细胞培养基800 μL。各组细胞置于37 ℃、5%CO2培养箱培养24 h后，取出小室用棉签擦拭上室，以4%多聚甲醛固定15 min，再以0.1%结晶紫溶液染色20 min，取出用PBS清洗并使用棉签擦拭上室。在光学显微镜下随机挑选5个不同视野，拍照并计数跨膜细胞。

2.3.2 NB细胞侵袭实验 取Matrigel基质胶，以无血清培养基按照体积比8 ∶ 1稀释，按50 μL/孔均匀铺在Transwell小室上室，置于37 ℃、5% CO2培养箱放置4～6 h待凝固。取对数生长期的IMR-32细胞和SH-SY5Y细胞，按照“2.3.1”项下方法分组，并按“经胰酶消化……0.1%结晶紫溶液染色20 min，取出用PBS清洗并使用棉签擦拭上室”等步骤同法操作。在光学显微镜下随机挑选5个不同视野，拍照并计数跨膜细胞。

2.4 TET对NB细胞相关蛋白表达水平的影响考察

采用Western blotting法检测。取对数生长期IMR-32细胞和SH-SY5Y细胞，按照“2.3.1”项下方法分组，经胰酶消化，1 500 r/min离心15 min后以4.0×105个/mL接种于6孔板内，待细胞贴壁后分别加入终浓度为0 μmol/L（正常对照组）、10 μmol/L（IMR-32细胞，TET组）或15 μmol/L（SH-SY5Y细胞，TET组）的TET甲醇溶液，置于37 ℃、5%CO2培养箱培养24 h。使用RIPA裂解液裂解并提取总蛋白，以BCA法测定蛋白浓度以确定上样浓度。所获蛋白以上样缓冲液×6作变性处理后，使用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）凝胶电泳分离，110 V电压转膜；使用5%脱脂奶粉封闭1 h，加MMP-2抗体（1 ∶ 1 000）、MMP-9抗体（1 ∶ 1 000）、β-catenin抗体（1 ∶ 1 000）、GSK3β抗体（1 ∶ 1 000）、p-GSK3β抗体（1 ∶ 1 000）及β-actin抗体（1 ∶ 2 000），在4 ℃下摇床孵育过夜；次日用TBST缓冲液漂洗10 min×3次，加入辣根过氧化酶标记抗体（二抗，1 ∶ 8 000），摇床上慢速常温孵育1 h；TBST缓冲液漂洗10 min×3次，加入ECL试剂显影。采用Quantity One 4.6.4分析软件测定条带灰度值，以目的蛋白与内参β-actin蛋白比较所得的相对灰度值表示目的蛋白表达水平。

2.5 统计学方法

应用SPSS 18.0软件对数据进行统计分析。数据均以x±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。P<0.05表示差异有统计学意义。

3 结果

3.1 TET对NB细胞的细胞毒性

结果显示，不同浓度的TET对IMR-32细胞和SH- SY5Y细胞的增殖均有抑制作用，并随TET浓度增加该抑制作用有增强趋勢。与空白对照比较，当TET浓度为5～20 μmol/L时，细胞存活率随着药物浓度的增加而显著降低，差异有统计学意义（P<0.05或P<0.01）；TET对IMR-32细胞和SH-SY5Y细胞的半数抑制浓度（IC50）分别为10.148、14.461 μmol/L。根据IC50数据，并考虑到尽量减少药物自身对肿瘤细胞的毒性作用，故后续实验中TET对IMR-32细胞和SH-SY5Y细胞的处理浓度分别设为10、15 μmol/L。不同浓度TET作用后IMR-32细胞和SH-SY5Y 细胞的存活率见图1。

3.2 TET对NB细胞迁移、侵袭能力的影响

3.2.1 细胞迁移实验结果 细胞计数结果显示，正常对照组 IMR-32细胞和SH-SY5Y细胞的跨膜数分别为（163.02±6.24）个、（118.13±7.50）个，TET组IMR-32细胞和SH-SY5Y细胞的跨膜数分别为（68.32±3.51）个、（61.24±5.03）个。与正常对照组比较，TET组跨膜细胞数均显著减少，差异均有统计学意义（P<0.01）。各组NB细胞迁移实验显微图见图2，跨膜细胞数柱形图见图3。

3.2.2 细胞侵袭实验结果 细胞计数结果显示，正常对照组IMR-32细胞和SH-SY5Y细胞的跨膜数分别为（401.43±10.96）个、（182.28±5.56）个，TET组IMR-32细胞和SH-SY5Y细胞的跨膜数分别为（206.12±8.83）个、（83.35±3.60）个。与正常对照组比较，TET组跨膜细胞数均显著减少，差异均有统计学意义（P<0.01）。各组NB细胞侵袭实验显微图见图4，跨膜细胞数柱形图见图5。

3.3 TET对NB细胞中MMP-2、MMP-9的蛋白表达水平的影响

与正常对照组比较，TET组IMR-32细胞和SH-SY5Y细胞中MMP-2、MMP-9蛋白表达水平均显著降低，差异均有统计学意义（P<0.01）。各组NB细胞中MMP-2、MMP-9蛋白表达电泳图见图6，蛋白表达水平柱形图见图7。

3.4 TET对NB细胞中β-catenin、GSK3β、p-GSK3β的蛋白表达水平的影响

与正常对照组比较，TET组IMR-32细胞和SH-SY5Y细胞中β-catenin、p-GSK3β蛋白表达水平均显著降低，差异均有统计学意义（P<0.01）；但各组间GSK3β的蛋白表达水平差异无统计学意义（P>0.05）。各组NB细胞中β-catenin、GSK3β、p-GSK3β蛋白表达电泳图见图8，蛋白表达水平柱形图见图9。

4 讨论

NB是儿童常见的恶性肿瘤疾病，严重威胁儿童生命健康。目前常用的手术、化疗、放疗、移植及生物治疗等方法并不能有效控制疾病，因此积极寻找新的NB治疗方法对于提高患者生存率、改善预后具有重要意义。粉防己作为传统中药具有悠久的药用史，越来越多的研究发现，粉防己中的有效成分TET在体外和体内均具有抗多种肿瘤的活性[11]。然而关于TET对NB的抗肿瘤作用却研究甚少。本研究结果显示，使用不同浓度的TET处理后，能明显抑制IMR-32细胞和SH-SY5Y细胞的增殖，且随TET浓度增加该抑制作用呈增强趋势；Transwell小室迁移实验和侵袭实验结果显示，TET能显著抑制NB细胞的迁移和侵袭能力。

MMPs家族在NB侵袭转移过程中发挥着重要功能。据文献报道，MMPs是锌依赖性肽链内切酶家族，能降解细胞外基质中的蛋白成分，破坏肿瘤细胞侵袭的组织学屏障，在肿瘤侵袭转移中起关键作用[12]。MMP-2和MMP-9是MMPs家族的重要成员，两者均属于明胶酶，能降解明胶和Ⅳ型胶原蛋白。在NB发生、发展过程中，MMP-2和MMP-9能促进NB的侵袭、迁移[13]。本研究结果显示，TET处理能显著降低IMR-32细胞和SH-SY5Y细胞中MMP-2、MMP-9的蛋白表达水平。

Wnt/β-catenin信號通路是生物体内广泛存在的信号传导途径，在NB发生、发展过程中发挥了重要作用，其中β-catenin和GSK3β是该信号通路的关键调节分子[14]。当Wnt/β-catenin信号通路被激活时，无法形成降解复合物，因此无法降解β-catenin，从而使β-catenin能转位进入细胞核，并与相应的转录因子结合形成复合物，进而调节下游靶基因表达，引发细胞增殖分化、细胞侵袭转移、组织形成等相应生理学改变；相反，当Wnt/β-catenin信号通路失活时，β-catenin被降解而无法发挥生物学功能[15-16]。研究发现，Wnt/β-catenin信号通路与多种肿瘤的侵袭、转移密切相关，中药成分如姜黄素可通过抑制Wnt/β-catenin信号通路来抑制小细胞肺癌的转移[17]。本研究通过Western blotting检测发现，TET能抑制p-GSK3β和β-catenin的蛋白表达，提示Wnt/β-catenin信号通路在TET抑制NB的迁移和侵袭过程中可能起到关键作用；但TET对GSK3β的蛋白表达未见明显影响，这可能与GSK3β蛋白在不同状态下磷酸化位点不同有关[18]。

综上所述，TET能抑制NB细胞增殖及迁移、侵袭能力，而下调MMP-2、MMP-9蛋白表达水平和抑制Wnt/β-catenin信号通路是其可能的作用机制。

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（收稿日期：2018-06-26 修回日期：2018-12-04）

（編辑：段思怡）