阿奇霉素对哮喘小鼠气道炎症及细胞因子表达的影响

杨军霞　郭英萌

[摘要] 目的 觀察支气管哮喘小鼠炎性细胞因子表达，探讨阿奇霉素对肺部炎症及细胞因子表达的影响。 方法 6～8周龄的雌性BALB/c小鼠32只，采用随机数字表法将其分为四组，A组：生理盐水对照组;B组：哮喘组;C组：阿奇霉素干预组;D组：地塞米松干预组，每组8只。分别于第0、7、14天予B、C、D组小鼠腹腔注射鸡卵白蛋白（OVA）25 μg+Al（OH）3 1 mg。致敏1周后，2%OVA生理盐水溶液雾化吸入激发。A组予等量生理盐水代替OVA致敏和激发，激发6 d。C组于第14天起，雾化吸入1 h后皮下注射阿奇霉素0.4 mg/mL，连续7 d。D组于第14天起，雾化吸入1 h后皮下注射地塞米松磷酸钠2 mg/kg，连续7 d。激发后24 h，观察各组小鼠肺组织病理表现，收集左肺支气管肺泡灌洗液（BALF）。采用酶联免疫吸附法（ELISA）检测白细胞介素-8（IL-8）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、嗜酸性粒细胞（EOS）百分比及白细胞计数。 结果 B、C、D组小鼠成功造模，存在哮喘发作症状及气道炎症病理表现。与A组比较，B组小鼠BALF中白细胞总数、EOS百分比、IL-8及TNF-α含量均显著升高，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。与B组比较，C组和D组小鼠BALF中白细胞总数、EOS百分比、IL-8及TNF-α含量均显著降低，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。C、D两组各项指标比较，差异均无统计学意义（P > 0.05）。 结论 阿奇霉素可以抑制IL-8、TNF-α的表达，阻碍Th2型细胞因子的生成，缓解气道炎症。

[关键词] 支气管哮喘;阿奇霉素;炎症;细胞因子

[中图分类号] R562          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-7210（2019）06（c）-0021-04

Effects of Azithromycin on airway inflammation and cytokine expression in bronchial asthma mice

YANG Junxia   GUO Yingmeng

Department of Pediatrics， Linyi Central Hospital， Shandong Province， Linyi   276400， China

[Abstract] Objective To observe the expression of inflammatory cytokines in bronchial asthma mice， and to explore the effect of Azithromycin on the expression of pulmonary inflammation and inflammatory cytokines. Methods According to random number table， 32 female BALB/c mice aged 6-8 weeks were randomly divided into four groups： group A， normal saline control group; group B， asthma group; group C， Azithromycin intervention group; group D， Dexamethasone intervention group， with 8 mice in each group. Mice in group B， C and D were intraperitoneally injected with ovalbumin （OVA） 25 μg （OH）3 1 mg at 0， 7， 14 days， respectively. After sensitization for 1 week， 2% OVA solution was nebulized and inhaled. Group A was sensitized and stimulated with normal saline instead of OVA for 6 days. In group C， Azithromycin （0.4 mg/mL） was injected subcutaneously 1 hour after atomization inhalation at day 14 consecutively for 7 days. In group D， 2 mg/kg of Dexamethasone Sodium phosphate was injected subcutaneously 1 hour after atomization inhalation at day 14 consecutively for 7 days. The pathological manifestations of lung tissues in each group were observed 24 hours after stimulation， and the left bronchoalveolar lavage fluid （BALF） was collected， and the percentage of interleukin-8 （IL-8）， tumor necrosis factor-α （TNF-α）， eosinophilic granulocytes （EOS） and white blood cell count were detected by enzyme linked immunosorbent assay （ELISA）. Results Mice in group B， C and D were successfully modeled and presented asthma attack symptoms and pathological manifestations of airway inflammation. Compared with group A， the total number of white blood cells， percentage of EOS， IL-8 and TNF-α contents in BALF of mice in group B were significantly increased， with statistically significant differences （P < 0.01）. Compared with group B， the total number of white blood cells， percentage of EOS， IL-8 and TNF-α contents in BALF of group C and group D were significantly reduced， with statistically significant differences （P < 0.01）. There were no statistically significant differences in the indicators between group C and D （P > 0.05）. Conclusion Azithromycin can inhibit the expression of IL-8 and TNF-α， inhibit the production of Th2 cytokines， and relieve airway inflammation.

[Key words] Bronchial asthma; Azithromycin; Inflammation; Cytokines

支气管哮喘是一种气道慢性炎症性疾病，Th2细胞在诱导和维持免疫炎症过程中起重要的作用。Th2细胞主要分泌白细胞介素-8（IL-8）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等促进IgE的合成、嗜酸性粒细胞（EOS）的生长与分化，以及黏液分泌、气道高反应（AHR）的发生。气道平滑肌细胞（ASMCs）具有收缩功能及分泌功能，能分泌趋化因子、细胞因子等多种炎性介质，对气道炎症的发生及发展起着重要的作用。研究表明[1-3]，与哮喘发生有关的Th2型细胞因子IL-8及趋化因子TNF-α等在ASMCs上均有表达，它们在参与气道炎症的发生、EOS的生长与分化以及AHR的发生过程中均起重要作用。

目前，糖皮质激素是预防和治疗哮喘的主要药物，但长期应用存在较多副作用，且越来越多的哮喘患者出现了激素抵抗的现象。近年来的研究发现阿奇霉素具有潜在的抗炎、免疫调节的作用[4-5]，哮喘患者应用阿奇霉素可以明显降低气道炎性反应，改善哮喘的症状、体征，降低AHR，且未见明显副作用。这些治疗作用可能是阿奇霉素抑制ASMCs的炎症引起的。本研究旨在观察阿奇霉素对哮喘小鼠炎性细胞因子表达的影响，探讨阿奇霉素对肺部炎症及细胞因子表达的影响，具体报道如下：

1 材料与方法

1.1 主要试剂及仪器

阿奇霉素注射液（苏州长征-欣凯制药有限公司，生产批号：121128）;地塞米松磷酸钠注射液（辰欣药业股份有限公司，生产批号：1210206432）;鸡卵白蛋白（OVA）（Ⅱ、Ⅴ级）（上海研生生化试剂有限公司）;DAB显色试剂盒[生工生物工程（上海）有限分公司];多聚赖氨酸（北京格瑞纳健峰生物技术有限公司）;大鼠IL-8、TNF-α酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒（美国R&D公司）;402Ai超声雾化器（上海鱼跃医疗设备有限公司）;FA1004型微量电子天平（精度：0.1 mg，上海赛德利思精密仪器仪表有限公司）;QL-902漩涡混悬器（海门市其林贝尔仪器制造有限公司）;AXTGL16M高速低温离心机（上海赵迪实验室仪器设备有限公司）;普通光学显微镜（苏州耀宏光电科技有限公司）;Qwin550w型计算机病理图像分析系统（德国LeicaQwin公司）。

1.2 实验动物

6～8周龄的BALB/c小鼠共32只，雌性，体重20～25 g，购自潍坊医学院（以下简称“我校”）实验动物中心。清洁喂养，环境温度控制在22～25℃，环境湿度控制在40%～70%，进水不限，喂养食物中不含OVA。本研究经我校动物试验伦理委员会审核并予以批准。

1.3 方法

1.3.1 分组模型建立

32只小鼠采用随机数字表法分为四组：A组，生理盐水对照组;B组，哮喘组;C组，阿奇霉素干预组;D组，地塞米松干预组。每组8只小鼠。清洁级复制哮喘模型[6-8]：分别于第0、7、14天，予B、C、D组小鼠腹腔注射OVA 25 μg+Al（OH）3 1 mg。致敏1周后第21～26天，将小鼠置于透明玻璃容器中，2% OVA生理盐水溶液雾化吸入。A组予等量生理盐水代替OVA致敏和激发。各组小鼠均每天激发1次，30 min/次，激发6 d。B组激发后未予任何药物干预。C组于第14天起，雾化吸入1 h后皮下注射阿奇霉素0.4 mg/mL，连续7 d。D组于第14天起，雾化吸入1 h后皮下注射地塞米松磷酸钠2 mg/kg，连续7 d。

1.3.2 试验方法

1.3.2.1 观察各组小鼠肺组织病理表现  激发后24 h（第27天），处死小鼠，打开小鼠胸腔取右肺组织，10%中性甲醛固定，脱水、包埋，制作蜡块，病理切片，进行苏木精-伊红（HE）染色，100×光镜下观察肺组织结构。

1.3.2.2 观察各组小鼠炎性细胞因子表达情况  激发后24 h（第27天），各组小鼠用37℃生理盐水1 mL进行肺灌洗，反复3次，收集左肺支气管肺泡灌洗液（BALF），采用ELISA法检测IL-8、TNF-α、嗜酸性粒细胞计数及白细胞计数。试验步骤严格按照試剂盒说明书进行。

1.4 统计学方法

采用SPSS 13.0统计软件对数据进行分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠症状表现比较

B组小鼠于雾化激发时出现烦躁不安、抓耳挠腮、呼吸急促、打喷嚏、流涎、大小便失禁、腹肌强直等哮喘反应;而C组及D组雾化激发时上述反应均减轻;A组几乎无任何反应。

2.2 各组小鼠肺组织病理表现比较

A组小鼠气道黏膜无增厚，气道周围无炎症细胞浸润，肺泡壁结构完整;B组小鼠气道黏膜充血水肿，气道周围较多炎症细胞浸润，肺泡结构被破坏;C组小鼠气道周围少量炎症细胞浸润，管壁无明显增厚;D组小鼠程度与C组小鼠相似。见图1（封四）。

2.3 各组小鼠BALF中白细胞总数和EOS百分比的比较

与A组比较，B组小鼠BALF中白细胞总数和EOS百分比均显著升高，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。与B组比较，C组和D组小鼠BALF中白细胞总数及EOS百分比明显降低，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。C、D两组白细胞总数和EOS百分比比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。见表1。

2.4 各组小鼠BALF中IL-8及TNF-α含量比较

与A组比较，B组IL-8及TNF-α含量显著升高，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。与B组比较，C组和D组IL-8及TNF-α含量显著降低，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。C、D两组IL-8及TNF-α含量比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。见表2。

3 讨论

既往研究发现，在慢性哮喘患者和动物模型中均存在气道上皮脱落、气管周围炎症细胞浸润、AHR等改变[9-12]。炎性细胞因子（如IL-8、TNF-α﹚是目前用于判断气道炎症的主要指标。气道炎症被认为是哮喘的本质，T细胞在控制气道炎性反应中起重要作用，Th1/Th2细胞比例失衡，Th2型细胞因子分泌增多在气道炎症的形成中发挥重要作用[2，13-14]。本研究发现：哮喘组小鼠支气管肺泡灌洗液中IL-8和TNF-α浓度均较正常对照组明显降低。与既往研究[15-16]结果相符。

大环内酯类抗生素不但有抗菌作用，同时还具备非特异性的抗炎平喘、免疫调节、降低气道高反应性、抑制黏液分泌及非抗菌的作用，尤其是对非特异呼吸道炎性反应，如弥散性细支气管炎﹑哮喘等有显著效果[16]。研究发现[17-18]，新大环内酯类抗生素如阿奇霉素，同时具有抗菌作用及抗炎免疫调节作用，能抑制多种炎性细胞因子和趋化因子的释放，减少中性粒细胞的迁移和趋化，减少血液及痰液中EOS的数目及EOS阳离子蛋白的含量，抑制气道杯状细胞的过度分泌。研究发现[19-21]，阿奇霉素可以抑制Th17细胞分化，从而减少IL-17、IL-8、TNF-α等炎症介质分泌，进而调节炎症细胞浸润，发挥抗炎作用。本研究结果显示：阿奇霉素干预的小鼠BALF中白细胞总数和EOS百分比均较哮喘组显著降低，肺组织气道炎症程度也较哮喘组明显减轻，BALF中TNF-α和IL-8水平明显降低，且这种作用与哮喘地塞米松比较，差异无统计学意义。结果提示，因阿奇霉素可发挥抗炎作用，抑制ASMCs的炎性反应，其抑制Th2细胞因子和改善炎症的作用与地塞米松相似。

综上所述，本研究发现阿奇霉素可以抑制IL-8、TNF-α的表达，阻碍Th2型细胞因子的生成，缓解气道炎症。

[参考文献]

[1]  Liang X，Wang J，Chen W，et al. Inhibition of airway remodeling and inflammation by isoforskolin in PDGF-induced rat ASMCs and OVA-induced rat asthma model [J]. Biomed Pharmacother，2017，95：275-286.

[2]  李菁，包军，鲍一笑，等.肺炎支原体肺炎患儿肺泡灌洗液病菌量及其与Th1/Th2细胞免疫应答的关系[J].临床儿科杂志，2015（8）：681-685.

[3]  Jin C，Shelburne CP，Li G，et al. Particulate allergens potentiate allergic asthma in mice through sustained IgE-mediated mast cell activation [J]. J Clin Invest，2011，121（3）：941-955.

[4]  胡立杰，陈云，王婷婷.阿奇霉素序贯疗法联合匹多莫德对支原体肺炎患儿血清炎性因子水平及免疫功能的影响[J].中国医药导报，2018，15（2）：132-135.

[5]  林冬丽，林道煌，张少冰，等.小剂量阿奇霉素对反复呼吸道感染患儿免疫功能的影响[J].中国医药导报，2017， 14（3）：106-108，132.

[6]  郑美梅，江勇，温武金，等.阿奇霉素对支气管哮喘小鼠气道重构及转化生长因子-β1表达的影响[J].中国医师杂志，2011，13（2）：158-161.

[7]  韩纪昌，戚冠斌，刘笑春，等.慢性哮喘患者肺组织IL-21和转录激活因子3的表达[J].国际呼吸杂志，2016，36（7）：520-523.

[8]  张方琪，韩新鹏，张芳，等.动态观察过敏原诱导的哮喘小鼠模型从急性炎症到慢性重塑的发展[J].中国病理生理杂志，2017，33（2）：380-384.

[9]  王满，于杜娟，关英慧，等.支气管哮喘患者血清白细胞介素-37水平的变化[J].中华结核和呼吸杂志，2013，36（6）：457-458.

[10]  韩纪昌，戚冠斌，刘笑春，等.慢性哮喘患者肺组织IL-21和转录激活因子3的表达[J].国际呼吸杂志，2016， 36（7）：520-523.

[11]  李海燕，郑有光，韩利红，等.难治性哮喘患者肺部感染病原菌分析及肺泡灌洗液与血清炎症因子水平[J].中华医院感染学杂志，2018，28（3）：355-359.

[12]  林香花，冯可青，郑素歌，等.甘草次酸对哮喘大鼠肺泡灌洗液白细胞计数及血清相关炎症因子的影响[J].中国老年学杂志，2016，36（11）：2613-2614.

[13]  王开梅，林志雄，胡祥英，等.呼吸道病毒感染对支气管哮喘患儿Th1/Th2细胞因子平衡的影响[J].中国医药导报，2019，16（5）：76-79.

[14]  李晓品，李艳红，许凤勤，等.阿奇霉素对肺炎支原体肺炎感染患儿Th1/Th2指标的影响研究[J].中华医院感染学杂志，2016，26（16）：3797-3799.

[15]  袁彬凡，吴东，何若云，等.哮喘-COPD重叠综合征机械通气患者肺泡灌洗液SP-D及IL-8意义分析[J].中国免疫学杂志，2016，32（7）：1035-1038.

[16]  王翠霞.小儿咳嗽变异性哮喘与肺炎支原体感染的关系及大环内酯类药物治疗的效果[J].临床肺科杂志，2015（3）：520-522.

[17]  李小莉，王威，郭纪元，等.阿奇霉素通过TRAF6/NF-κB/VEGF信号通路抑制哮喘大鼠气道平滑肌细胞增殖[J].重庆医学，2017，46（21）：2898-2901.

[18]  刘伟，周娟，孙莹，等.阿奇霉素对支气管哮喘患儿外周血辅助性T淋巴细胞9和辅助性T淋巴细胞17功能的影响[J].中华实用儿科临床杂志，2015，30（18）：1405-1408.

[19]  Douglas LC，Choi J，Esteban-Cruciani N. Azithromycin treatment in children hospitalized with asthma：a retrospective cohort study [J]. J Asthma，2019，1：1-7. doi：10.1080/02770903.2019.1590590.

[20]  張丽，白茹芹，柏立浩，等.地氯雷他定对过敏性哮喘豚鼠模型肺泡灌洗液IL-4和IL-13水平的影响[J].实用临床医药杂志，2014（16）：105-106，111.

[21] 吴浩峰，刘树生.甲泼尼龙、阿奇霉素联合给药对小儿难治性支原体肺炎的治疗效果及安全性观察[J].中外医学研究，2017，15（18）：108-109.