松弛素对脂多糖所致大鼠急性肺损伤肺纤维化的作用*

毕小菁， 王文军， 代丽， 罗丹， 陈梦晴

西南医科大学附属医院呼吸内科(四川泸州 646000)

急性肺损伤(acute lung injury，ALI)继发于各种直接或间接的肺损伤，常导致急性低氧性呼吸衰竭，大多数患者在临床上有急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)[1]。ALI/ARDS病死率高，有研究表明1984—2006年11月期间ALI/ARDS病死率为44.3%[2]。ALI/ARDS在病理学上表现为弥漫性肺泡损伤、肺泡-毛细血管通透性增加，随着病情进展导致间质性肺炎和肺纤维化[3]。有研究表明，纤维增生是ALI的早期反应，也是一个重要的治疗靶点[4]。因此，研究ALI肺纤维化具有十分重要的临床价值。松弛素是一种肽类激素，其作用在妊娠和分娩过程中十分重要[5]。同时也参与了高血压和心力衰竭的病理生理过程，血管生成和骨重建，以及癌症和纤维化的分子途径[6-7]。近年来，有研究表明，松弛素抗纤维化性质在抗腕管综合征、肾脏纤维化、肝脏纤维化、心肌纤维化、气道重构等方面都具有一定保护作用[8-12]。目前国内外尚无松弛素治疗ALI后肺纤维化的研究报道。因而，本研究从2016年10月至2018年10月，通过探索松弛素在ALI肺纤维化中的作用及其机制，旨在为ALI肺纤维化患者的临床治疗策略和预后提供理论依据和实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物及主要试剂 健康SPF级雄性SD大鼠，周龄7～8周，体重180～200 g,购买于成都达硕实验动物有限公司。重组人松弛素-2(recombinant human relaxin-2)，规格25 μg/支，购于Peprothch公司。脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)，规格10 mg/支，购于Sigma公司。TGF-β1抗体， 规格 200 μg/mL，购于Santa公司。Samd-2抗体，规格100 μg/mL，购于Santa公司。

1.2 动物分组及模型制作 将50只SD大鼠按随机数字表法分为5组，分别为生理盐水对照组(NS组，n=10)、模型组(LPS组，n=10)、松弛素低剂量组(RLX-L组，n=10)、松弛素中剂量组(RLX-M组，n=10)、松弛素高剂量组(RLX-H组，n=10)。NS组大鼠给予一次性腹腔注射生理盐水5 mg/kg处理，其余各组大鼠给予一次性腹腔注射LPS 5 mg/kg处理。1 h后NS组及LPS组大鼠开始皮下注射生理盐水2 μg/(kg·d)，RLX-L组、RLX-M组、RLX-H组大鼠分别开始皮下注射稀释后的重组人松弛素-2 1、2、4 μg/(kg·d)。连续给药14 d。

1.3 标本采集 24 h后每组各取大鼠5只，称重后处死(戊巴比妥钠160 mg/kg)，暴露胸腔，结扎气管，将肺组织与其他组织游离，取下肺组织，用冰盐水冲洗血管，用无菌吸水纸吸干水分，称重，即为湿肺重量(mg)，放置于无菌器皿中。用无菌组织剪取右肺中叶浸泡于4%多聚甲醛24 h后用石蜡包埋，备行苏木精-伊红染色(hematoxylin-eosin staining,HE染色) 。14 d后以同样的方式处死每组剩余5只大鼠，称重肺组织，取左肺组织液氮速冻后放置于-80℃冰箱冻存，用于羟脯胺酸含量的检测；取右肺中叶组织，浸泡于4%多聚甲醛24 h后用石蜡包埋，备行HE染色、Masson染色及免疫组化染色。

1.4 观察指标及测定方法

1.4.1 肺指数 以湿肺重量(mg)与大鼠体重(g)的比值表示。

1.4.2 羟脯胺酸(hydroxyproline,HP)测定[13]HP是体内胶原蛋白的主要成分，我们测量HP含量以反映胶原蛋白的含量，以此反映肺组织纤维化的程度。用比色法测定肺组织HP含量。取100 mg肺组织于含10 mL 6 mol/L HCL水解管中，放置于130℃恒温干燥箱中水解5 h。用NaOH调整pH值至6.5～7，用蒸馏水将体积调为30 mL。取1 mL标本溶液与1 mL 0.05 mol/L氯胺T溶液混合，放置室温下孵育20 min。然后加入1 mL 20%二甲基苯甲醛，放置60℃恒温水浴中孵育20 min，测定每个样品在550 nm处的吸光度。结果用HP(mg)/湿肺重量(g)。

1.4.3 病理学检测 用Ashcroft分数[14]半定量评估肺纤维变化。将石蜡包埋的大鼠右肺中叶组织连续切片，厚度5 μm，然后用二甲苯脱蜡，再由从高浓度到低浓度乙醇进行水合，最后入蒸馏水进行HE染色和masson染色。每只大鼠制作3张切片，每张切片的严重程度用显微镜下纤维化分数表示。肺纤维化分数由0～8分进行表示，具体如下：0分表示正常肺组织；1分表示肺泡或支气管壁最小纤维化增厚；2～3分表示中等程度增厚，但肺组织结构未破坏；4～5分表示肺纤维程度增加伴有一定的肺组织结构损害以及纤维带或小的纤维团块形成；6～7分表示肺组织结构严重破坏以及大片纤维化区域形成，包括蜂窝肺；整个区域全部纤维化则评为8分。分析每张切片下10个区域，所有区域的平均纤维化分数即为这张切片的纤维化分数，每组大鼠所有切片的平均纤维化分数即为该组大鼠纤维化分数。

1.4.4 TGF-β1、Samd-2蛋白表达测定 用免疫组化法[15]对进行TGF-β1、Samd-2蛋白表达半定量分析。将石蜡包埋的大鼠右肺中叶组织切片，然后用二甲苯脱蜡，再由从高浓度到低浓度乙醇进行水合。将切片加入0.1 mol/L柠檬酸钠缓冲液中，煮沸10 min进行抗原修复；用组化笔画圈后将切片滴入3%过氧化氢，室温下孵育；加入山羊血清封闭液进行封闭，室温下孵育；滴加抗TGF-β1抗体或抗Samd-2抗体，放在4℃冰箱中过夜；第2天，取出湿盒，室温下复温后每张片子加入50 μL链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶溶液，再滴加100 μL二氨基联苯胺溶液染色，再用苏木素复染使细胞核变为蓝色，最后用低浓度到高浓度乙醇脱水。切片晾干后封片，盖上盖玻片，晾干后放在显微镜下观察。若蛋白表达为阳性，则在显微镜下可见细胞内出现棕黄色颗粒，颜色越深，说明其表达越强。应用Leiea系统对显微镜下图像进行采集。应用Image-Pro Plus(6.0)图文分析软件对采集的图像进行分析。每只大鼠制作3张切片，每张切片随机取5个视野(×200),测量每个区域棕黄色颗粒的累积积分光密度(integral optical density，IOD),每组大鼠所有切片积分光密度的平均值即为该组大鼠平均光密度值(mean of IOD)，作为 TGF-β1、Samd-2蛋白表达量。

2 结果

2.1 肺指数 在第14天，与NS组相比，LPS组的肺指数显著增加(P<0.05)；然而，与LPS组相比，重组人松弛素-2各干预组大鼠肺指数明显降低(P<0.05)。松弛素各干预组之间相比，RLX-M组与RLX-H组之间差异无统计学意义(P>0.05)，但两组与RLX-L组之间差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

2.2 HP含量 LPS组肺组织HP含量明显高于NS组(P<0.05)；与LPS组比较，松弛素各干预组含量均明显降低(P<0.05)。松弛素各干预组之间比较，RLX-L组与RLX-M组之间及RLX-M组与RLX-H组之间差异无统计学意义(P>0.05)，但RLX-L组与RLX-H组间差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 各组肺指数、HP含量比较

表1 各组肺指数、HP含量比较

组别n肺指数(mg/g)HP(mg/g)纤维化分数(分)NS组57.44±0.191.75±0.730.60±0.55LPS组511.67±0.80∗6.44±0.82∗7.80±0.45∗RLX-L组59.12±0.24∗△5.35±0.21∗△6.40±0.55∗△RLX-M组58.13±0.29∗△▲5.08±0.25∗△5.20±0.45∗△RLX-H组58.03±0.19∗△▲4.92±0.12∗△▲4.20±0.45∗△

*与NS组比较P<0.05；△与LPS组比较P<0.05；▲与RLX-L组比较P<0.05

2.3 HE染色 光镜下观察造模后24 h肺组织，NS组大鼠肺组织肺泡壁正常，肺泡腔清晰，肺泡内无炎性细胞浸润；LPS组大鼠肺组织肺泡结构严重破坏，肺泡腔内可见出血、渗液，部分肺泡壁塌陷，大量炎症细胞浸润；松弛素各干预组较LPS组有所减轻，见图1。14 d NS组大鼠肺组织结构基本正常，LPS组肺组织正常肺泡结构破坏、肺泡间隔断裂、肺泡融合、肺间质可见较多胶原纤维，松弛素各干预组较LPS组胶原纤维减少、纤维化有不同程度减轻，见图2。进行纤维化评分，NS组肺纤维化评分0～1分，LPS组7～8分，RLX-L组6～7分，RLX-M组5～6分，RLX-H组4～5分，见表1。

2.4 masson染色 NS组肺泡结构完整，仅极少量蓝色胶原纤维沉积。LPS组可见正常肺泡结构的破坏，肺泡腔及肺泡间隔蓝色胶原纤维弥漫分布；松弛素各干预组胶原纤维亦较NS组增多，但胶原纤维分布较LPS组均有不同程度减轻，见图3。

2.5 免疫组化 NS组可见肺泡上皮细胞有少量 TGF-β1、Smad2 表达，LPS组肺泡上皮细胞、巨噬细胞、炎细胞、内皮细胞内均有TGF-β1、Smad2阳性表达，且较NS组明显增强，而松弛素各干预组TGF-β1、Smad2表达均较模型组显著减弱，见图4、5。定量分析显示，LPS组TGF-β1、Smad2 的平均光密度值均明显高于NS组(P<0.05)，而松弛素各干预组均明显低于LPS组(P<0.05)。松弛素各干预组之间比较，各组TGF-β1平均光密度值均差异有统计学意义(P<0.05)；RLX-L组与RLX-M组之间Smad2差异无统计学意义(P>0.05)，但与RLX-H组间差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

3 讨论

造成ALI/ARDS的原因有很多，比如感染、胶原血管疾病、药物不良反应、休克、急性嗜酸性粒细胞肺炎、免疫介导的肺出血和血管炎、放射性肺炎等[16]。其中革兰阴性杆菌感染是引起ALI的常见因素。细胞壁的LPS是革兰阴性杆菌内毒素的主要成分，也是最主要的致病因素[17]。有研究发现，在ARDS患者中，肺纤维化在近期和远期预后中发挥关键作用[18]。本实验中，腹腔注射LPS后24 h，大鼠肺组织肺泡壁明显破坏，炎性细胞严重浸润，14 d后LPS组肺泡腔、肺泡间隔弥漫性胶原纤维沉积，肺纤维化评分明显高于NS组，提示本实验成功建立了ALI肺纤维模型。

肺纤维化伴有成纤维细胞异常增殖和细胞外基质的大量沉积。机体发生肺损伤后，肺成纤维细胞多种细胞因子的促进下进行表型调节，转化为肌成纤维细胞[19]。而肌成纤维细胞因其细胞外基质和纤维化介质的高表达，是肺纤维化组织重塑过程的关键因素[20]。在众多促进成纤维细胞向肌成纤维细胞转化的细胞因子中，TGF-β1尤为关键[21]。TGF-β1能够诱导肺成纤维细胞分化为肌成纤维细胞，并且可以引起细胞外基质蛋白的大量合成[19]。有研究表明，TGF-β1介导的Smads通路是纤维化发生的可能机制之一[22]， TGF-β1能结合并激活Ⅰ型TGF-β受体结合，然后导致Smad2被磷酸化，再转移进入细胞核内充当转录调节因子，最终导致纤维化[23]。本实验中，LPS组TGF-β1、Smad2 较NS组均明显表达，提示TGF-β1、Smad2的参与可能促进肺纤维的形成。

A:NS组；B:LPS组；C:RLX-L组；D:RLX-M组；E:RLX-H组

A:NS组；B:LPS组；C:RLX-L组；D:RLX-M组；E:RLX-H组

A:NS组；B:LPS组；C:RLX-L组；D:RLX-M组；E:RLX-H组

A:NS组；B:LPS组；C:RLX-L组；D:RLX-M组；E:RLX-H组

A:NS组；B:LPS组；C:RLX-L组；D:RLX-M组；E:RLX-H组

表2 各组平均光密度值比较

表2 各组平均光密度值比较

组别TGF-β1Smad2NS组3.39±0.394.70±0.38LPS组16.78±3.42∗23.46±0.87∗RLX-L组10.39±0.50∗△21.18±2.46∗△RLX-M组8.72±0.44∗△▲19.33±2.50∗△RLX-H组6.39±0.39∗△▲#15.47±0.73∗△▲#

*与NS组比较P<0.05；△与LPS组比较P<0.05；▲与RLX-L组比较P<0.05；#与RLX-M组比较P<0.05

有报道[24]，松弛素与1 型松弛素受体结合后，可促进一氧化氮合成的增加，而一氧化氮有抑制Smad2的磷酸化作用，进而抑制TGF-β1受体向细胞内传递信号，从而抑制成纤维细胞增殖、活化、及分化为肌成纤维样细胞，从而起到抑制纤维化的作用。有研究表明，松弛素能减轻TGF-β1诱导的心肌纤维化[25]。另外在一项研究松弛素对肾纤维化的作用的研究中，结果表明松弛素可通过抑制Smad2的磷酸化，干扰TGF-β1，从而抑制肾纤维母细胞的分化和抑制胶原的沉积[26]。既往已有研究表明松弛素在抗肺纤维化中也具有一定的作用，即在一项动物实验中，松弛素基因敲除后的小鼠出现显著的肺胶原沉积，提示松弛素起着抑制肺胶原沉积的重要作用[27]。本实验中重组人松弛素-2各干预组肺纤维化程度明显较LPS组轻，提示松弛素可缓解ALI肺纤维化，且TGF-β1、Smad2在干预组中的表达明显较LPS组弱，提示松弛素可能通过抑制TGF-β1、Smad2减轻ALI肺纤维化。

综上所述，本研究结果显示，重组人松弛素-2可能通过抑制TGF-β1、Samd-2，从而在一定程度上抑制肺纤维化的发展。这可能是松弛素治疗肺纤维化的机制。但本实验为动物实验，仅为松弛素治疗肺损伤肺纤维化提供实验理论及临床治疗思路，用于治疗人类肺损伤肺纤维化还需要更多的实验及临床研究。