PEG-8000模拟干旱胁迫对马铃薯组培苗叶绿素和类胡萝卜素含量的影响

杨喜珍，杨 利，覃 亚，刘 磊，杨 欢，谢 婉

（西藏日喀则市农业科学研究所，西藏 日喀则 857000）

光合作用可以为植物提供生长及发育所需要的各种有机物质，在植物的生长和发育过程中起着重要作用[1]。作物体内叶绿素含量的高低是直接反映其光合能力的重要指标之一，叶绿素的含量对光合速率和光合产物的形成有着直接影响，最终影响作物产量和品质的提高[2,3]。类胡萝卜素是植物体中重要的抗氧化物质，在减轻和消除由干旱等逆境引发的活性氧伤害方面直接发挥作用，同时通过逆境激素ABA 间接在植物抗旱中发挥作用[4]。水分亏缺对光合系统的影响十分复杂，不仅影响叶绿素合成，也影响光合器官结构及光电子传递系统[5]。国内外学者对干旱胁迫下不同植物叶绿素和类胡萝卜素含量的变化进行了大量研究[6-10]。

马铃薯是中国第四大粮食作物，对水分的亏缺非常敏感[11]，干旱是马铃薯生产的重要限制因素[12]，因而国内外学者在马铃薯抗旱育种和抗旱栽培方面进行了广泛研究[11-13]。马铃薯块茎产量形成依赖于叶片的光合作用，水分亏缺可减少功能叶面积和光合速率，缩短植株绿色体的持续期，叶绿素含量随干旱胁迫时间的延长而降低，叶绿素荧光下降，光合作用降低，从而造成马铃薯减产[5]。本试验采用不同浓度聚乙二醇（PEG-8000）模拟干旱胁迫，研究不同马铃薯品种（系）组培苗叶绿素和类胡萝卜素含量的变化，旨在阐明马铃薯组培苗不同强度干旱胁迫下幼苗光合色素的变化特点，为马铃薯抗旱机制的研究及抗旱品种筛选提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验于2015年8～12月在西藏自治区马铃薯工程研究中心完成。

供试马铃薯品种（系）为‘渭薯1号’、‘东农303’、‘青薯9号’、‘春薯2号’、‘D613’、‘200902’共6个品种（系）的脱毒组培苗。其中‘D613’为中国农业科学院蔬菜花卉研究所提供的彩色马铃薯高代品系，‘200902’为西藏自治区薯类脱毒中心提供的系统选育品系。‘青薯9号’抗旱性较强[14-16]，而‘东农303’抗旱性较弱[17,18]。其他品种（系）的抗旱性不确定。各品种生育特性见表1。

PEG-8000 购于Amresco 公司，化学式为HO（CH2CH2O）nH，n=108～125，纯度99.9%。

1.2 试验方法

1.2.1 PEG培养基制作

参考邓珍等[19]的方法，配制0、5%、10%、15%、20%（W/V）的PEG溶液（含2 mmol/L MES缓冲液），pH调至5.8±1，高压灭菌。之后等体积倒入已灭菌凝固的MS 培养基（琼脂7 g/L、蔗糖30 g/L）中，平衡72 h后，在无菌工作台上把上层液体从培养瓶中倒掉。所得的固体培养基即为含PEG固体培养基。其中0处理不添加PEG，设为对照。

表1 品种（系）特性介绍Table 1 Characteristics of varieties(lines)

1.2.2 试验处理

将在常规培养基中预培养长势一致的马铃薯脱毒苗，按单节茎段剪切到PEG培养基中进行培养。每瓶接入12 个茎段，每个处理80 瓶。培养瓶直径0.65 cm，内装40 mL培养基。培养温度（23±2）℃，光强3 000 lx，每天光照16 h。培养50 d后测定各指标，每个品种（系）每次取3个重复，每个重复3瓶。

1.2.3 叶绿素及类胡萝卜素含量测定

取新鲜干净试验材料，剪碎称取0.1 g，加入少量石英砂和微量CaCO3，加入2～3 mL无水乙醇研磨成匀浆，再加入10 mL无水乙醇研磨至组织变成白色，静置3～5 min。滤纸和漏斗用无水乙醇湿润后，将提取液过滤到25 mL棕色容量瓶里，用无水乙醇反复冲洗研钵和漏斗，定容到刻度线[20]。使用UV-5800型紫外可见光分光光度计测定665，649和470 nm的OD值，空白组为无水乙醇溶液。

结果计算：

Ca=13.95×OD665-6.88×OD649

Cb=24.96×OD649-7.32×OD665

Ct=Ca+Cb

Ch=（1 000×OD470-2.05Ca-114.8Cb）/245

叶绿素含量=[色素浓度（C）×提取液体积×稀释倍数]/样品鲜重（或干重）

式中：Ca 为叶绿素a 浓度；Cb 为叶绿素b 浓度；Ct为总叶绿素浓度；Ch为类胡萝卜素浓度。

1.2.4 数据分析

数据统计和作图采用Excel 2013进行。方差分析、邓肯氏多重比较和因子分析采用SPSS 20。采用平均隶属函数法进行综合分析。

隶属函数值公式为：Ui=（Xi-Ximin）/（Ximax-Ximin）

式中：Ui为第i个指标的的隶属函数值；Xi为第i个指标的原始数据；Ximax和Ximin为样品组中第i个指标的最大值与最小值[21]。

相对指标=（处理指标/对照指标）×100%[19]

2 结果与分析

2.1 不同浓度PEG胁迫对马铃薯试管苗叶绿素a含量的影响

由表2看出，‘D613’叶绿素a含量随PEG浓度升高而升高，分析‘D613’以外的其他品种（系），在5%PEG胁迫下，各品种（系）叶绿素a含量均较对照低，‘东农303’降低幅度最大。在10%PEG 胁迫下，‘东农303’和‘200902’叶绿素a含量继续降低，而‘渭薯1号’、‘青薯9号’和‘春薯2号’叶绿素a含量回升。在15%PEG胁迫下，各品种（系）叶绿素a含量均较10%PEG 胁迫下升高，其中‘渭薯1 号’、‘D613’、‘青薯9号’和‘春薯2’号的叶绿素a含量超过对照。20%PEG 胁迫下，‘200902’和‘春薯2 号’的叶绿素a含量较15%PEG胁迫下略降低，其他品种持续升高，其中‘D613’、‘渭薯1号’和‘青薯9号’叶绿素a含量超过对照，分别是对照的2.05、1.55和1.37 倍。变异系数最大的为‘D613’，其次是‘东农303’，最小为‘青薯9号’。

表2 不同浓度PEG胁迫下马铃薯试管苗叶绿素a含量（mg/g FW）Table 2 Chlorophyll-a contents of potato plantlets in vitro under different PEG concentrations

2.2 不同浓度PEG胁迫对马铃薯试管苗叶绿素b含量的影响

由表3 看出，除‘D613’叶绿素b 鲜样含量随PEG浓度升高而升高，其他品种（系）均表现为先降低后升高的趋势。分析‘D613’以外的其他品种（系），在5%PEG胁迫下，各品种（系）叶绿素b含量均低于对照，‘东农303’降低幅度最大，其次是‘渭薯1号’。在10%PEG胁迫下，‘东农303’和‘200902’叶绿素b含量继续降低，而‘渭薯1号’、‘青薯9号’和‘春薯2 号’叶绿素b 含量回升。在15%PEG 胁迫下，各品种（系）叶绿素b含量均较10%PEG胁迫下升高，其中‘渭薯1号’、‘青薯9号’的叶绿素b含量超过对照。20%PEG胁迫下，‘200902’和‘春薯2号’的叶绿素b含量较15%PEG胁迫下略降低，其他品种持续升高，其中‘渭薯1号’和‘青薯9号’叶绿素b含量超过对照。

2.3 不同浓度PEG胁迫对马铃薯试管苗类胡萝卜素含量的影响

由表4看出，除‘D613’类胡萝卜素含量随PEG浓度升高而升高，其他品种（系）均表现为先降低后升高的趋势。分析‘D613’以外的其他品种（系），在5%PEG胁迫下，各品种（系）类胡萝卜素含量均低于对照，‘渭薯1号’降低幅度最大，其次是‘春薯2号’。在10%PEG胁迫下，各品种（系）较5%PEG胁迫下类胡萝卜素含量回升。在15%PEG胁迫下，除‘春薯2号’，其他各品种（系）类胡萝卜素含量均较10%PEG胁迫下升高且超过对照。20%PEG胁迫下，各品种的类胡萝卜素含量均超过对照，‘D613’的类胡萝卜素含量是对照的5.52倍，其次是‘青薯9号’，为对照的1.86倍，最低的是‘200902’，为对照的1.13倍。

表3 不同浓度PEG胁迫下马铃薯试管苗叶绿素b含量（mg/g FW）Table 3 Chlorophyll-b contents of potato plantlets in vitro under different PEG concentrations

表4 不同浓度PEG胁迫下马铃薯试管苗类胡萝卜素含量（mg/g FW）Table 4 Carotenoid contents of potato plantlets in vitro under different PEG concentrations

2.4 不同浓度PEG胁迫对马铃薯试管苗总叶绿素含量的影响

由表5看出，除‘D613’总叶绿素含量随PEG浓度升高而升高，其他品种（系）均表现为先降低后升高的趋势。分析‘D613’以外的其他品种（系），在5%PEG 胁迫下，各品种（系）总叶绿素含量均低于对照，‘东农303’降低幅度最大，其次是‘渭薯1号’。在10%PEG胁迫下，‘东农303’和‘200902’总叶绿素含量继续降低，而‘渭薯1号’、‘青薯9号’和‘春薯2号’总叶绿素含量回升。在15%PEG胁迫下，各品种（系）总叶绿素含量均较10%PEG胁迫下升高，且‘渭薯1号’、‘青薯9号’和‘春薯2号’超过对照。20%PEG胁迫下，‘渭薯1号’和‘青薯9号’总叶绿素含量超过对照。

2.5 不同浓度PEG胁迫对马铃薯试管苗胡萝卜素/总叶绿素比值的影响

由表6看出，胡萝卜素/总叶绿素的比值变化趋势不一致，‘D613’随PEG浓度升高而升高，‘渭薯1号’和‘青薯9 号’呈现出先降低后升高的趋势，‘200902’呈现出先升高后略降低的趋势。在5%PEG下，‘渭薯1号’和‘青薯9号’的比值分别是对照的0.75和0.97倍，而‘东农303’的增幅最大，是对照的1.50 倍。在20%PEG 下，‘东农303’和‘D613’分别是对照的2.45和3.09倍，而‘渭薯1号’和‘青薯9号’分别是对照的1.12和1.22倍。

表5 不同浓度PEG胁迫下马铃薯试管苗总叶绿素含量（mg/g FW）Table 5 Total chlorophyll contents of potato plantlets in vitro under different PEG concentrations

表6 不同浓度PEG胁迫下马铃薯试管苗类胡萝卜素/总叶绿素Table 6 Carotenoid/total chlorophyll of potato plantlets in vitro under different PEG concentrations

2.6 不同浓度PEG胁迫对马铃薯试管苗叶绿素b/a的影响

由表7看出，在0～20%PEG，各品种（系）叶绿素b/a浓度的值变化略微呈先升高后降低的趋势，与总叶绿素含量的变化趋势相反。对照处理中，‘青薯9号’的比值最大，‘D613’比值最小，分别为0.280和0.262。其中‘200902’的变异系数最大，为12.47%，‘D613’变异系数最小，为5.74%。

2.7 马铃薯试管苗各生长指标在不同浓度PEG胁迫下变异分析

为筛选鉴定不同品种马铃薯组培苗对干旱胁迫反应的最佳PEG浓度，分析了不同浓度PEG下各指标在不同品种间的变异系数（表8）。各指标在不同PEG浓度下的变异系数不同，叶绿素a、叶绿素b、总叶绿素和类胡萝卜素/总叶绿素变异系数在对照下最大，类胡萝卜素变异系数在5%PEG 下最大，为46.33%，在15%PEG下最小。为综合考虑相同PEG浓度下各指标的变异性，采用隶属函数法对各指标的变异系数进行转换，分别计算各指标的隶属函数值，比较平均隶属函数值，值越大，说明变异越大。

表7 不同浓度PEG胁迫下马铃薯试管苗叶绿素b/叶绿素aTable 7 Chlorophyll-b/chlorophyll-a of potato plantlets in vitro under different PEG concentrations

表8 不同浓度PEG下品种间各指标的变异系数（%）Table 8 Coefficients of variation under different PEG concentrations

综合表2～8的结果可以看出，对照的变异系数最大，说明在不含PEG的处理中，不同品种由于遗传基础不同即使在完全相同的生长条件下生长也不一致；在含有PEG的培养基中，马铃薯组培苗受到干旱胁迫生长受到影响，各生理指标发生变化，20%PEG 胁迫下的平均隶属函数值较5%、10%和15%PEG胁迫下的值高，表明在20%PEG胁迫下品种之间测得的指标值差异较大。

通过各指标的变异系数比较，发现类胡萝卜素、类胡萝卜素/总叶绿素的变异系数较大，说明这2 个指标对干旱较敏感，而叶绿素b/a 变异系数较小，说明该指标在干旱胁迫下可以保持一定的稳定性。

2.8 马铃薯试管苗各生长指标在不同浓度PEG胁迫下变异分析

计算分析各品种（系）指标在不同浓度PEG间的变异系数的隶属函数值（表9），在0～20%PEG浓度梯度不同，各指标的变异系数的隶属函数值不同，叶绿素a变异系数的隶属函数值‘D613’最大，‘青薯9号’最小，类胡萝卜素变异系数的隶属函数值‘D613’最大，‘东农303’最小。采用平均隶属函数值法对各品种（系）的指标变异系数进行综合分析，从结果可以看出，变异系数的隶属函数值从大到小依次为‘D613’、‘东农303’、‘200902’、‘渭薯1 号’、‘春薯2号’和‘青薯9号’。平均隶属函数值越大，说明该品种（系）受胁迫影响导致的生理生长变化越大。

表9 不同品种（系）各指标变异系数的隶属函数值Table 9 Subordinate function value of coefficients of variation under different PEG concentrations

3 讨 论

一般认为对水分胁迫敏感性高的品种总叶绿素含量变幅较大，抗旱性差[19]。聂华堂[20]认为抗旱性越强的树种干旱胁迫下叶绿素含量降幅越小。冯淑华[21]研究发现植物在水分胁迫时，叶绿素含量增加。杨宁等[22]研究高山离子芥试管苗幼苗发现，PEG胁迫下叶片总叶绿素含量呈现先升高后下降的趋势。抗艳红等[23]利用PEG处理正常生长的马铃薯组培苗4 d后发现各处理单位面积上叶绿素含量随胁迫程度增加表现出下降的趋势，随胁迫强度加大，叶绿素含量又有所回升，这与本研究的结果相似。本研究中‘D613’叶绿素a 含量、叶绿素b、总叶绿素含量随PEG浓度升高而升高，其他品种（系）均表现为先降低后升高的趋势。马玉花等[24]研究亦发现肋果沙棘（Hipphae neu-rocpa）叶片叶绿素a、b及总叶绿素含量从对照到轻度胁迫有微量降低，随着干旱胁迫程度的加剧，总体均呈现上升趋势。分析原因可能是不同的植物抗旱机制不同，叶绿素对干旱胁迫的反应不同，彩色马铃薯植株的叶绿素含量对干旱的反应与常规品种不一样。常规马铃薯品种叶绿素出现先降低后升高的趋势，其中抗旱性强的品种在低强度干旱胁迫下叶绿素含量降幅小，在高强度干旱胁迫下叶绿素含量增幅大。分析原因可能是轻度干旱胁迫下胁迫减弱叶片叶绿素的生物合成过程，同时加速叶绿素分解，使叶绿素含量有减小的趋势。随着干旱胁迫强度加大，时间延长，植株叶片含水率降低，叶片组织液浓缩而使叶片单位面积叶绿素的浓度增加。张丽莉等[25]研究发现，干旱胁迫后马铃薯组培苗叶绿体变形甚至解体。可以推测，植株在轻度或短暂的干旱胁迫下由于叶绿素合成的减缓及叶绿素的解体会直接造成叶绿素含量降低，随着干旱胁迫的加重及干旱时间的延长，植株通过自身调节机制，如叶片含水量的降低，叶片组织液浓缩，甚至是反馈性的提高叶绿素合成速率，以提高单位面积的叶绿素含量，减缓单位面积光合速率降低的速度，从而维持机体生长所需要的能量合成。实际生产中，作物在受到一定程度的干旱胁迫后亦有表现出叶色更绿更暗的现象。而随着胁迫强度的进一步提高，在20%PEG下，‘春薯2号’和‘200902’的叶绿素a、b 及总叶绿素含量又出现下降，分析原因，可能是该品种的抗旱体系受到更高程度的伤害，通过提高单位面积的叶绿素含量减缓单位面积光合速率降低速度的机制已经被破坏。推测随着胁迫时间的延长，或者PEG浓度的更高，其他品种的叶绿素含量也会出现降低的现象。文爱华等[8]自然失水胁迫处理米槁（Cinnamomum migao H. W. Li）22 d发现随着胁迫时间的增加，叶绿素a、b含量呈先降低后升高再降低的趋势。

本试验中，类胡萝卜素含量除‘D613’随PEG浓度升高而升高，其他品种（系）均表现为先降低后升高的趋势。其趋势与叶绿素含量变化较接近，但其相对降幅和相对增幅都较叶绿素大，说明类胡萝卜素含量对干旱胁迫的反应比叶绿素更敏感。常规品种类胡萝卜素出现先降低后升高的趋势，其中抗旱性强的品种在低强度干旱胁迫下含量降幅小，在高强度干旱胁迫下含量增幅大。分析原因可能是轻度干旱胁迫下胁迫减弱叶片类胡萝卜素的生物合成过程，使类胡萝卜素含量有减小的趋势，随着干旱胁迫强度加大，时间延长，植株叶片含水率降低，叶片组织液浓缩，同时诱导了类胡萝卜素相关基因的表达而使叶片单位面积类胡萝卜素的浓度增加。文爱华等[8]研究亦发现米槁的类胡萝卜素含量随干旱胁迫时间的增加先下降后上升。有研究证明干旱胁迫下马铃薯β-胡萝卜素羟化酶1基因表达增加，推测干旱会诱导类胡萝卜素的合成[26]。

张明生和谈锋[27]提出叶绿素a/b比值可以判断植物的抗旱能力。张武[28]研究认为干旱地区马铃薯叶片中叶绿素b/a比值与品种抗旱性呈极显著正相关，比值越大品种抗旱性愈强。本试验中各品种（系）对照间的叶绿素b/a值差异不大，是否与抗旱性相关有待进一步考证。各品种（系）叶绿素b/a值在不同PEG处理间的变异系数较其他指标的变异系数小，说明该指标较其他指标在干旱下更稳定。黄承建等[29]研究亦发现苎麻受长时间严重干旱胁迫对叶绿素a/b值影响很小。牟筱玲和鲍啸[30]在对棉花的研究中亦发现叶绿素a/b比值基本不变。在本研究中，b/a值变化略微呈先升高后降低的趋势，与总叶绿素含量的变化趋势相反，总叶绿素先降低后升高，说明在总叶绿素含量降低的过程中，叶绿素a 浓度降低更快，而在总叶绿素含量升高的过程中，叶绿素a升高的速度更快，表明叶绿素a比叶绿素b对干旱的反应更为敏感。这与马玉花等[24]研究发现肋果沙棘叶片在严重干旱下叶绿素a相对叶绿素b变化更大的结果相一致。

本研究中类胡萝卜素/总叶绿素值的比值整体有升高的趋势，这与许丽颖[31]对李树的研究结果一致。抗旱性越强的品种，比值越稳定，抗旱性越弱的品种，受干旱胁迫比值升高越高。分析原因为抗旱性越强的品种，叶绿素较类胡萝卜素的含量稳定，在轻度干旱胁迫下，2种色素的含量降幅越小，其中类胡萝卜素比叶绿素含量下降更快，所以比值降低，而在中度干旱胁迫下，叶绿素和类胡萝卜素含量上升，类胡萝卜素含量上升更快，所以比值升高。而抗旱性越弱的品种，轻度干旱胁迫下，2种色素的含量受影响，降幅越大，其中类胡萝卜素较叶绿素下降慢，所以比值升高，在中度胁迫下，叶绿素和类胡萝卜素含量上升，类胡萝卜素含量上升更快，所以比值持续升高。在色素含量上升过程中，抗旱性强的品种比值较稳定，而抗旱性差的品种该比值升高幅度大，推测原因可能是抗旱性差的品种较抗旱性强的品种中叶绿素含量增高的速度比类胡萝卜素增高的速度更慢。

邓珍等[19]研究认为，固体培养下15%PEG-8000浓度下品种间差异最大，是鉴定马铃薯品种组培苗对干旱胁迫反应的最佳浓度。李志燕[32]认为，固体培养条件下8%PEG-6000浓度为鉴定和评价不同马铃薯品种之间耐旱性强弱的最佳浓度。王谧[14]研究认为，浓度为5%PEG-6000下马铃薯生长指标变化达到显著差异。本研究结果为固体培养下20%PEG-8000胁迫下培养40 d能更好地反应马铃薯组培苗受PEG模拟干旱胁迫后各品种之间叶绿素和类胡萝卜素含量变化的差异。

不同品种受干旱影响后各指标的变异系数不同，可能与不同品种抗旱机制不同有关。‘D613’在干旱条件下会积累更多的叶绿素和类胡萝卜素，类胡萝卜素的积累比叶绿素更多，或许在干旱胁迫下，彩色品种利用增加色素来应对逆境的机制更发达，而常规品种其他抗旱机制更发达。其他各品种（系）的叶绿素和类胡萝卜素含量在低浓度PEG 胁迫下有轻度的下降趋势，而‘D613’并没有体现，推测是彩色品种色素含量变化对干旱更敏感，在极轻度的干旱胁迫下就会使色素含量降低，随之诱导了色素的加速合成，这个极轻度的干旱胁迫或许比5%PEG 更低，未在本试验设置范围内。本研究中各品种（系）在受干旱胁迫时所导致的叶绿素和类胡萝卜素相关指标变化程度与抗旱综合评价的结果并不完全一致，彩色品种‘D613’的变化最大，抗旱综合评价其抗旱性最强，而其他常规品种（系）结果相反，整体呈现出抗旱性强的品种受干旱导致的指标变化程度小，而抗旱性弱的品种受影响大，所以对彩色马铃薯和常规马铃薯进行抗旱评价时如果单采用色素指标，并不能全面综合反映出植株的抗旱性。

马铃薯干旱胁迫下生理变化过程复杂，并且随着胁迫强度和胁迫时间的变化而有所不同，因此无法简单的用某一项或者几项生理值的变化作为抗旱性鉴定的指标。因此，今后抗旱鉴定工作的重点应从分子水平上阐明马铃薯抗旱机制，选用正确的综合性抗旱评价方法，提高马铃薯抗旱性鉴定的科学性和准确性。