C57BL6小鼠前列腺癌原位移植瘤模型的建立及其MRI表现

薄其付，李胜男，李桂庆，刘玉玺，刘峰*

1.潍坊医学院附属医院肿瘤科，山东潍坊 261053；2.潍坊医学院医学影像学系，山东潍坊 261053；*通讯作者 刘峰 liufengwfmc@163.com

前列腺癌是欧美男性第二大致死性癌症[1]。随着我国人口老龄化的加剧，老年男性的比例不断增加，前列腺癌的发病率呈持续上升趋势[2]。目前国内的前列腺癌病例构成以晚期为主[3]。因此，建立前列腺癌动物模型对新型抗癌药物的研究有重大意义。常见的前列腺癌动物模型包括种植型和外科原位移植型。种植性前列腺癌动物模型按部位分为皮下种植、腹腔内种植、肾包膜下种植以及骨骼种植等[4]；外科原位移植型包括原位瘤细胞注射法和瘤组织块移植法[5]。尽管通过细胞悬液法建立的前列腺癌原位移植瘤模型较为成功，远处转移率高，但由于小鼠前列腺解剖结构较小，操作空间有限，细胞悬液注射时容易溢出靶器官或误注入血管而造成人为转移；另外，即使未将细胞悬液直接注入血管，在注射细胞悬液后的10～180 min内，细胞悬液也会自发进入淋巴管或血管，从而造成人为的远处转移[6]。本研究参考文献[7]采用的组织块原位种植法，利用C57BL6小鼠建立前列腺原位肿瘤模型，观察其影像学特点，为探索前列腺癌的生长转移机制及其药物实验提供适宜的动物模型。

1 材料与方法

1.1 实验动物及试剂 C57BL6雄性近交系小鼠35只（济南朋悦实验动物繁育有限公司，动物许可证号：Scxk鲁20140007），鼠龄6～8周，体重18～23 g；恒温（20～26℃）、恒湿（40%～70%）、无菌隔离饲养笼内饲养；自由进食清洁水及高压灭菌小鼠料（购自北京市实验动物中心）。

小鼠前列腺癌细胞株RM-1（购自中国科学院上海细胞生物研究所）；胎牛血清（购自杭州四季青胎牛血清公司）；RPMI-1640细胞培养基（无硝酸钙，含2.05 ml谷氨酰胺，购自美国HyClone公司）；胰蛋白酶-EDTA消化液（购自北京Solarbio公司）。

1.2 仪器 MR（3.0T，GE）；双目连续变倍体视显微镜（上海精密，XTL2300）；游标卡尺；电子天平（MP21001，上海恒平）；生物组织包埋机（KD-BM，瑞士Leica）；轮转切片机（RM2235，瑞士Leica）。

1.3 方法

1.3.1 细胞培养 将小鼠前列腺癌细胞株RM-1用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液于5% CO2、37℃细胞培养箱内培养，每隔1 d换1次培养液，瘤细胞贴壁并生长至>70%，用胰蛋白酶消化并吹散，制成单细胞悬液。

1.3.2 C57BL6小鼠前列腺癌模型建立 采用随机数字表法选择6～8周龄C57BL6雄鼠4只，用乙醚法麻醉，将RM-1前列腺癌肿瘤细胞株传代3次后注射（细胞浓度为2×106个/ml）到小鼠背部皮下，每只注射0.1 ml，次日起观察肿瘤生长情况。

在上述小鼠皮下肿瘤模型直径长至1 cm时，采用随机数字表法选择2只小鼠作为小鼠原位肿瘤移植模型材料给予4%水合氯醛0.1 ml/10g。剥离肿瘤组织后，将取出的瘤组织块浸泡在0.9%氯化钠溶液中剪成约1 ml注射器针头大小（用1 ml注射器针头将其吸住且不至于轻易漏掉为准）备用。组织块浸泡时间不超过30 min。小鼠用上述麻醉方法麻醉，仰卧于硬纸板上并固定，常规备皮消毒，沿小鼠下腹部腹白线作长1.0～1.5 cm切口，显露腹腔。在10倍物镜下寻找膀胱将其向头端翻转，并向两侧推开脂肪组织，显露前列腺，镜下呈粉红色岛状结构，有明显的腺体组织特征。由一人在显微镜下主导找到前列腺的准确位置，另一操作者在主导人的引导下将提前准备好的瘤组织块用1 ml注射器注射到前列腺组织包膜下，然后将器官归位，用6-0可吸收肠线直接关腹，待小鼠苏醒后回笼。术中操作要求轻柔、准确，避免损伤正常组织。按上述步骤共制作前列腺癌原位移植瘤模型鼠30只。

1.4 动物模型结果的评价

1.4.1 大体观察 自肿瘤种植完成起每天观察小鼠的精神状态、饮食、活动等一般生命体征；小鼠每隔3 d称重1次。

1.4.2 影像学观察 肿瘤种植完成后第8天采用随机数字表法选择6只模型鼠行MRI扫描，观察肿瘤大小、侵犯部位、淋巴结转移及远处转移情况。MRI扫描方法：扫描序列轴位T2WI压脂序列（TR 2100 ms，TE 90 ms），冠状位T2WI压脂（TR 3000 ms，TE 90 ms），轴位扩散加权成像（TR 3950 ms，TE 77 ms），b值为600 s/mm2，矩阵128×96，视野90 mm×120 mm，扫描层厚3 mm，间隔0.3 mm，激励次数4。

1.4.3 病理学观察 待小鼠前列腺原位种植肿瘤形成后，用颈椎脱臼法处死小鼠后取其肿瘤组织，用游标卡尺测量肿瘤长径和短径，并参考文献[6]计算肿瘤体积。将肿瘤组织经4%多聚甲醛溶液固定，包埋。自固定液中取出标本，流水冲洗过夜。参照文献[8]进行梯度乙醇脱水各15 min；二甲苯Ⅰ-二甲苯Ⅱ各20 min；浸蜡2 h（石蜡温度60℃），包埋。完成制片后在显微镜下观察。

1.4.4 主要观察指标 主要观察肿瘤成瘤效果以及该模型的肝脏、肺、脾脏、肾脏、肾上腺、椎体及淋 巴结等转移情况。比较该肿瘤模型的形态学特点与影像学表现的符合程度。

1.5 统计学方法 采用SPSS 22.0软件，计量资料以x±s表示，计算模型鼠肿瘤体积，总体呈正态分布。采用配对样本t检验对MRI测量结果与游标卡尺测量结果进行比较，P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 实验动物大体观察结果 模型鼠在瘤体植入后第1周状况均良好，精神正常，皮毛光滑，进食正常，体重无减轻，活动度正常。7 d左右腹部可触及直径约1 cm肿瘤结节，质地较硬。8～15 d一般状况呈进行性衰竭表现，鼠毛失去光泽，进食减少，体重减轻，活动下降；且上述症状随着时间延长而进行性加重，直至呼吸浅快不能进食。

2.2 建模及影像学结果 模型鼠解剖后可见较大的前列腺癌病灶，肿瘤向前膨出，将包膜挤出一定角度和高度提示包膜受累；肝脏、肾脏表面可见单个或多个转移瘤组织，边界清、体积小。此种方法成瘤率为96.7%（29/30），周围淋巴结转移率为96.7%（29/30），腹水形成率为96.7%（29/30），肝转移发生率为93.3%（28/30），肾转移发生率为0.33%（1/30），肉眼未见明显肺部转移，小鼠平均生存时间（12.7±1.8）d。MRI结果见图1。

图1 模型鼠肿瘤MRI图像。冠状位T2WI可见肿瘤（箭）位于下腹部，形态规则，与周围组织分界清楚，呈等信号，信号均匀（A）；轴位T2WI（箭）位于下腹部，形态不规则，边界不清，信号尚均匀（B）

2.3 病理学结果 瘤组织呈不规则的近椭圆形，包膜不完整，质中，呈灰白、灰黄结节样，切面灰白，部分切面有出血坏死，瘤组织与残存前列腺组织界限不清；光镜下可见大量肿瘤细胞，形态不规则，细胞质浓染，呈多形性，核质比增大，可见异常病理性核分 裂象；大部分腺体被肿瘤细胞破坏，肿瘤组织呈条索 状或散在成团杂乱分布于前列腺体间质中（图2）。

图2 小鼠前列腺癌组织。箭示前列腺正常腺体区域，箭头示肿瘤区域（HE，×10）

2.4 MRI与游标卡尺测量结果比较 MRI与游标卡尺对小鼠模型肿瘤体积的测量结果分别为（505.17±196.24）mm3、（460.33±185.59）mm3，两者差异无统计学意义（t=2.374，P=0.064）。

3 讨论

与西方国家相比，我国前列腺癌发病率尚处于低水平。随着我国医疗水平的改善、国民生活水平的提高和饮食习惯的西方化，前列腺癌的发病率也呈不断增高趋势[9]。由于前列腺癌发病早期症状较轻，容易被忽视，确诊时疾病大多已经进行到晚期或转移的可能性较大[3]。前列腺癌在人类体内的发展是一个多步骤的过程，通过多个阶段最终转移到骨、肺、肝等处，因此建立一种合适的动物模型并阐明其机制，进而寻找不同的治疗方法以控制肿瘤的进展和远处转移具有重要意义[10]。既往研究对前列腺癌动物模型建立的不同方法进行了尝试与探讨。Bobek等[7]进行反复试验后对原位种植技术进行改进，通过前列腺癌细胞先尝试接种至裸鼠皮下形成肿瘤后，再将瘤组织取出，分切成1 mm3等体积瘤组织块，然后将其种植到小鼠背侧叶，划开前列腺包膜，放入事先制备的瘤组织块，用8-0可吸收线缝合包膜，再用6-0可吸收线关腹。但这种方法对操作者的个人技术、实验室设备要求较高，且操作者需进行专门的训练和多次练习达到熟练的程度后方可实行。在汲取前人研究成果的基础上，本研究对小鼠前列腺癌原位移植模型的建立进行了积极探索与创新，采用价格相对低廉、饲养环境要求不高的C57BL6小鼠作为实验小鼠，实验过程中在体视显微镜下，用注射器注射法将瘤组织块注射到前列腺组织包膜下，然后将器官归位，用6-0可吸收肠线直接关腹，从而降低了实验的难度，缩短了实验操作的进程。

本研究建立了C57BL6小鼠前列腺癌原位移植瘤模型，并运用MRI观察其肿瘤生长和转移特点。实验结果表明，此法建立的原位组织块种植模型成瘤率为96.7%，周围淋巴结转移率为100%；肝转移发生 率为90%；肾转移率为0.33%，均与既往研究结果相近[11-12]。实验过程中肉眼观察未发现有明确的肺部转移灶，可能与荷瘤小鼠生存期短、过早发生肝衰竭死亡有关。同时，该实验中还观察到模型鼠腹水形成率极高，近乎达100%，提示瘤组织可能侵犯腹膜进而损伤腹膜毛细血管，使血管通透性增加，导致大量液体与蛋白质渗入腹腔。然而，此项观察结果鲜有相关文献报道，具体机制尚需进一步研究验证。该实验中瘤组织的T2WI表现与人类相似，呈中等信号，采用MRI对肿瘤体积的测量结果与模型鼠解剖后用游标卡尺的测量结果差异无统计学意义，与国外相关文献报道相符[13]。

随着动物模型技术的不断改进和发展，近年来源于患者原代肿瘤组织的肿瘤移植模型（patient-derived xenograft，PDX）受到关注。但PDX模型操作技术要求高，标本从手术室获得后需要外科医师、组织学家和研究者密切配合。同时，由于患者来源的肿瘤组织数量有限，会受到医学伦理道德的限制，造成已有的原代模型数量少，而传代的样本需进行组织病理学检测，确定与原始样本的一致性，最终在经历了这一系列精确复杂的操作后，PDX模型的移植成瘤率平均仅为25%左右[14-15]。本实验建立的C57BL6小鼠前列腺癌原位移植模型较PDX模型具有建模周期短、移植瘤成功率高、操作简单等特点，且其影像学和病理学表现与人类前列腺癌相似，可以作为观察人类前列腺癌的动物模型。

本研究的局限性为：人类前列腺癌骨转移发生率较高，但本模型并未观察到有相关骨转移迹象，其原因可能与生存期短、小鼠较早出现肝衰竭而影响肿瘤进一步发展与转移有关。