隔药饼灸对慢性支气管炎模型大鼠外周血中中性粒细胞的影响

孙 璐，谭 静，阳仁达，李双艳，廖宗力，魏 星，罗 明

（湖南中医药大学针灸推拿学院，湖南长沙410208）

慢性支气管炎（chronic bronchitis，CB）是气管、支气管黏膜及其周围组织的慢性非特异性炎症［1］，临床主要以咳嗽、咳痰或伴有喘息等为主要症状，时间连续2年或2年以上，每年持续3个月以上［2］，根据临床表现可将其归属于中医的“咳嗽”“痰饮”及“喘证”等范畴，是一种严重危害身体健康的常见疾病。中性粒细胞为吞噬细胞固有免疫应答的主要细胞，作为一种吞噬细胞，具有吞噬与杀菌功能，并介导炎症反应，在机体抗感染免疫中通过吞噬并杀灭微生物而发挥重要作用，是固有免疫细

胞的主力军［3］。灸法治疗疾病时以其产生的温热效应来取得疗效，现临床应用较广。本实验采用的隔药饼灸指将中药研末后加入少量赋形剂制成小饼状，并隔此药饼用艾炷或艾条灸的一种灸法，本研究旨在探讨隔药饼灸预处理对慢性支气管炎大鼠外周血中PMN的影响并探索其治疗慢性支气管炎的可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物与分组 健康SD大鼠48只（体重200～250 g），月龄3～4个月，雌雄各半。按随机数字表法分为空白组、模型组、穴位隔药饼灸组、核酪口服液对照组4组，每组12只。由湖南中医药大学动物实验中心提供［动物合格证编号：SCXK（湘）2017-0003］，保持饲养温度20～25℃，湿度50%～70%。

1.1.2 实验药物 核酪口服液：上海旭东海普药业有限公司生产，批号：170205；艾炷：选用“神灸300灸”由艾炷苏州东方艾绒厂出产（型号：东方1型）；玉屏风散：黄芪、白术（炒）、防风按 2∶2∶1的比例称取，所用中药材由湖南中医药大学第一附属医院中药房提供，上三味药烘干，粉碎后过200目筛，装瓶备用。

1.1.3 试剂与仪器 氯化铵溶血剂、多聚甲醛、PBS、水合氯醛、Hank′s液、碘化丙啶标记的大肠菌液（长沙唯尔生物科技有限公司生物试剂经部）。JY3002型电子天平（上海精密科学仪器有限公司）；常温低速离心机（湖南中医药大学针灸推拿学院实验室提供）；HHS-2电子恒温不锈钢水浴锅（上海南阳仪器有限公司）；FC500流式细胞仪（美国贝克曼公司）；Motic B5显微摄像系统（麦克奥迪实业集团公司）；LEICA DM LB2型双目显微镜（德国LEICA公司）；移液器（德国Eppendorf公司）；7001×UVI数字彩色显微图像分析系统（Optimas 6.5，美国）。

1.2 实验方法

1.2.1 造模 参考相关文献，采用改良烟熏法复制慢性支气管炎大鼠模型［4］。大鼠适应性饲养1 w后开始实验，空白组置于正常无烟环境中饲养；其余3组均放置于特制的1 m×1 m×1 m的烟室中，用烟叶、锯末、刨花各50 g，点燃对大鼠进行烟熏，每天上午、下午分别1次，每次30 min，持续1个月。造模成功标志：大鼠出现咳嗽、喘鸣、呼吸急促，且咳痰质地较清稀，口鼻流出黏液性分泌物，并先后出现精神不振，喜静甚至蜷伏不动，行动迟缓，痰多，纳少，消瘦便溏，体毛脱落，舌色发青等症状和体征。显微镜下观察：气管黏膜层、黏膜下层有大量炎症细胞浸润，存有分泌物及脱落细胞；肺内细支气管可见大量炎症细胞。

1.2.2 选穴与干预方法 选穴：Ⅰ组：肺俞、肾俞；Ⅱ组：关元、足三里。取穴定位参照十二五规划教材《实验针灸学》［5］。

隔药饼灸组操作方法：于造模成功后开始对大鼠进行隔药饼灸治疗，找准穴位后剪毛，注意不可损伤皮肤，用100 g/L硫化钠脱除根部绒毛，将事先准备好的直径0.5 cm药饼放置穴位皮肤上并用胶布固定，点燃进行施灸，待艾炷燃毕，再换另外一壮，每穴持续灸 3～4 壮（20 min），1次/d，Ⅰ组、Ⅱ组穴位隔日交替施灸，持续干预2 w。核酪口服液组给药方法：核酪口服液按人体用药量换算成大鼠等效剂量作为大鼠用药量灌胃，给药量为2 mL/100 g体重。空白组及模型组则分别灌服同等体积的生理盐水。

1.2.3 标本采集与检测 实验期间，密切观察动物的一般状态如体重、毛色、精神状态等。待治疗结束，禁食不禁水12 h后腹主动脉放血处死动物。腹腔注射10%水合氯醛（3.5 mL/kg）麻醉大鼠，腹主动脉取血，取各组大鼠抗凝全血2 mL，流式细胞术观察血液中PMN吞噬指数。

放血处死大鼠后，取出气管及肺脏，将气管和右肺置于4%的甲醛固定液中固定1 d，再用乙醇脱水，石蜡包埋，4～5 μm 切片，进行 HE 染色，在光镜下观察各组大鼠支气管肺组织的病理变化。

外周血中PMN噬吞指数的检测：采用流式细胞术，取各组大鼠抗凝全血100 μL，加入到1.5 mL Eppendorf离心管，放置冰上10 min，然后加入1×109/mL 碘化丙啶标记的大肠菌液 10～20 μL，混匀，进行水浴温度在37℃，10～15 min后迅速取出放入冰中10 min。把样本移入流式测定试管，加冷Hank′s洗涤1次，弃上清，加入氯化铵溶血剂2 mL，室温下放置10 min，离心，弃上清液。冷Hank′s再洗涤1次，弃上清液，用流式细胞仪检测PMN荧光强度的变化，计算PMN吞噬率。

1.3 统计学方法

所有数据用SPSS20.0软件进行统计分析，所有数据以均数±标准差（±s）表示。经正态性检验后，组间比较方差齐时采用LSD法，方差不齐时采用 Tamhane′s法进行方差分析，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况

空白组大鼠整体情况较好，无咳嗽气喘等症状，精神较好，活动灵敏，饮食正常，毛发柔顺光泽，体重无明显变化。模型组造模7 d后口鼻流出黏液性分泌物，活动后出现咳嗽气喘、呼吸困难等症状，喜静不喜动，反应略迟钝，精神不佳，饮食减少，消瘦便溏，毛发凌乱无光泽，体重减轻等症状和体征。穴位隔药饼灸组及核酪口服液对照组造模后症状同模型组，穴位隔药饼灸组治疗后观察到大鼠咳嗽气喘、口鼻分泌物、饮食情况等较前逐渐好转。核酪口服液对照组症状亦有所改善。

2.2 病理组织观察结果

4组大鼠光镜下观察气管和肺组织的病理改变：空白组肺泡及支气管均正常，无炎症细胞浸润，气管黏膜层及黏膜下层正常，无炎症浸润。模型组肺泡扩张，炎症细胞浸润，气管黏膜层及黏膜下层大量炎症细胞浸润，管腔内有脱落细胞。穴位隔药饼灸组支气管及肺泡正常，散在少量炎症细胞；气管黏膜层及黏膜下层正常，有少量散在的炎症细胞。核酪口服液组肺泡正常，巨噬细胞增多；气管黏膜下层有弥漫性的淋巴细胞浸润，管壁完整，无脱落。结果见图1。

图1 气管和肺组织病理观察结果

2.3 各组大鼠全血PMN吞噬指数

与空白组比较，模型组PMN吞噬指数明显升高（P＜0.01），说明慢性支气管炎大鼠吞噬能力较正常大鼠明显升高；与模型组比较，穴位隔药饼灸组、核酪口服液组PMN吞噬指数降低，差异有统计学意义（P＜0.05），且隔药饼灸组降低更明显（P＜0.05），提示隔药饼灸与核酪口服液组均能降低慢支大鼠PMN吞噬指数，且隔药饼灸作用更明显。结果见表1。

表1 各组大鼠PMN吞噬指数变化比较 （±s）

表1 各组大鼠PMN吞噬指数变化比较 （±s）

注：与空白组比较，1）P＜0.01，与模型组比较，2）P＜0.05；与穴位隔药饼灸组比较，3）P＜0.05

组别 n PMN吞噬指数空白组 12 1.90±0组 12 7.63±3.70模型.191）穴位隔药饼灸组 12 3.79±1.022）核酪口服液组 12 5.57±1.872）3）

3 讨论

相关研究表明，呼吸道疾病的发病过程中，患者的呼吸道内可能存在活跃的修复及损伤机制，中性粒细胞产生的许多介质在这一过程中起重要作用［6］。中性粒细胞是介导炎症反应的重要效应细胞，在机体非特异性免疫防御中起重要作用［7］。中性粒细胞为吞噬细胞固有免疫应答的主要细胞，具有趋化、吞噬、呼吸爆发等生物学特性［8］。当病原体进入机体后，中性粒细胞开始活化，在相关趋化因子作用下通过血管的内皮细胞而进入血管间隙，随着血液流动到达感染部位，继而与病原体接触后形成伪足并将病原体包围，中性粒细胞质膜逐渐内陷形成吞噬体，继而发挥杀灭病原体作用［9］。所以中性粒细胞在机体抗感染过程中通过吞噬并杀灭微生物而发挥重要作用。在整个炎症反应过程中，中性粒细胞通过表面模式识别受体与相关分子模式作用而得到激活，然后其受体与表达在血管内皮上的配体相互作用进行迁徙，最终通过吞噬作用和脱颗粒作用对病原体及损伤组织进行清除［10］。由此可知，当机体中的相关炎症因子处于上升时，机体可能产生一些炎症反应，如机体呼吸道支气管内出现炎性分泌物，上皮细胞增厚甚至脱落，继而出现咳嗽、气喘等症状；通过实验观察得出，穴位隔药饼灸能明显降低慢支大鼠PMN吞噬指数，继而减轻模型大鼠的炎症反应，减轻临床症状。

艾灸是一种传统且有效的治疗方法，具有温通经络、活血化瘀、扶助正气、散寒止痛等功效，《内经》中记载，针灸所不能达到之处，艾灸可以达到［11］。艾产生效果的可能根本原因是其燃烧时产生的温热效应，其基本原理以“温通”为主。炎性反应以“红、肿、热、痛”为典型特征，是机体气机阻滞的表现，通过相关研究发现，炎性反应的某些内在特征与传统理论中关于气机失调、经脉阻滞的病理相符合。姜劲峰等［12］通过相关研究阐述了艾灸抗炎的机制：艾灸治疗的主要病理基础是炎性反应，针对炎性反应所导致的一些功能障碍、气血阻滞等病理症状，都可以用艾灸的“温通”效应发挥较好的疗效。因此，艾灸的温通作用可以达到舒筋活络、抗炎止痛等效果，从而用于治疗慢性支气管炎等炎性反应病变。张伟等［13］通过悬灸有效降低了哮喘模型大鼠的中性粒细胞，从而有效缓解其急性发作期症状，说明艾灸可通过干预中性粒细胞的信号转导而发挥减轻哮喘的作用。张梦雪等［14］在治疗非小细胞肺癌患者时，发现麦粒灸疗法可使机体中性粒细胞走向程序性凋亡，有效缓解患者的相关炎性反应状态，减轻其痛苦，并且能提高患者的免疫功能，从而提高其生存质量。

本实验在灸的基础上采用隔药饼灸，是指在穴位上贴敷药饼，再将艾炷放于药饼上，点燃艾柱再进行治疗的一种方法。穴位隔药饼灸原理为：艾灸燃烧时产生的热效应，加上药饼中药物小分子通过皮肤渗透到皮下甚至毛细血管，再加上腧穴的治疗作用，通过经络循行而达病所，从而起到舒筋活络、调理脏腑的治疗效果。王小平等［15］认为灸的作用主要是通过温热作用，促使穴位局部毛细血管扩张，加速血液循环，药饼的有效成分通过小分子透过皮肤到达血液中，沿经络循行至病所，以驱散内伏寒邪，使肺气升降恢复正常，达到扶正固本的治疗目的。此次选穴为肺俞、肾俞、关元、足三里，以起到扶正祛邪、培本补虚的作用。陈向华等［16］研究发现艾灸大鼠“肺俞”“肾俞”穴能改善模型大鼠支气管壁肌层增厚、黏膜水肿情况，减少炎性细胞浸润。张余山［17］研究表明，电针患者足三里、关元穴后，发现其各项炎症反应指标均较治疗前显著下降，可减轻脓毒症患者的炎症反应。此次药饼选方为源自《丹溪心法》的玉屏风散，方由黄芪、白术、防风三味药物组成，是中医扶正固本的经典方剂。现有研究认为，玉屏风散加味方可增强模型大鼠SIgA和SC的表达，降低TNF-α和IL-8等炎性因子的表达［18］，提示该方药可干预气道炎症微环境，调节患者免疫功能，抑制炎症反应。刘海亮等［19］证实给予玉屏风散的小鼠耳炎症反应减轻，炎细胞浸润明显减少；同时能显著降低小鼠耳组织匀浆中 IL-4、IL-5、IL-9、EL-13 水平，对 Th2 型过敏性炎症有显著的抑制作用。通过查阅多篇文献可发现，隔药饼灸利用对穴位的持续温灸加以药物的渗透作用，达到温通气血、扶正祛邪等效果，使人体消除病痛。其治疗效果明显，深受广大患者青睐。

本实验研究结果显示：造模以后，模型组PMN吞噬指数明显升高（P＜0.05）；穴位隔药饼灸及灌服核酪液治疗后，大鼠血清PMN吞噬指数明显降低（P＜0.05），且隔药饼灸后降低更明显（P＜0.05）。综上所述，慢性支气管炎大鼠外周血PMN吞噬指数增高，其炎症可刺激PMN增多，使其释放更多的炎症因子，导致慢支感染反复，穴位隔药饼灸及核酪口服液均可降低PMN，穴位隔药饼灸效果更好。隔药饼灸可增强机体抗感染能力及药物杀菌作用，这为隔药饼灸治疗慢性支气管炎提供了实验依据。但其具体调节通路信号有待进一步深入研究，且该方法在临床的可行性亦有待进一步认识与研究。