广藿香酮对COPD小鼠肺部损伤保护作用机制研究

张味娜，张明明，俞 敏

(宁海县第一医院 药剂科，浙江 宁海 315600)

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease, COPD)的特征为持续性气流受限，可导致气道和肺脏慢性炎性反应增强。作为一类慢性疾病，COPD对病人、家庭及社会经济压力持久且繁重，成为全球范围内关注的健康问题[1]。COPD的发病机制主要包括蛋白酶/抗蛋白酶失衡学说、炎症学说、氧化抗氧化失衡学说等。COPD 的主要病变特征是淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞(PMN)和巨噬细胞(AM)等浸润的小气道炎症反应。COPD等慢性呼吸疾病的治疗原则包括隔离含有污染颗粒的空气，解除支气管内皮细胞周围持续的炎症以及氧化应激环境[2-5]。广藿香酮是广藿香(Pogostemoncablin(Blanco)Benth)的重要化学成分之一，具有良好的抗菌抗炎作用[6-7]。广藿香酮对胃溃疡大鼠有一定的保护作用[8]，抑制炎症调节因子防止小鼠内毒素性休克[9]；直接阻断T细胞增殖，改变炎性细胞因子分布从而治疗自身免疫性疾病[10]。另外，广藿香酮通过其抗氧化和抗炎特性表现出显著的光保护活性[11]。本研究通过构建COPD小鼠模型观察广藿香酮对肺损伤的保护作用及其作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 雄性ICR小鼠60只，体重18～22 g，由苏州大学比较医学中心提供，饲养室温25±1 ℃，相对湿度55±10 %，灯光12 h交替。

1.2 试剂和仪器 广藿香酮(纯度99%)由第二军医大学提供，地塞米松购自浙江仙琚制药股份有限公司，超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)试剂盒购自南京建成生物有限公司，白介素-6(IL-6)、白介素1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)酶联免疫试剂盒购自南京凯基生物有限公司，核因子E-2-相关因子2(Nrf-2)、血红素氧合酶1(HO-1)、磷酸化核因子κB抑制蛋白(p-IκBα)、核因子κB抑制蛋白(IκBα)、磷酸化核因子κBp65(p-NF-κBp65)、核因子κBp65(NF-κBp65)、GAPDH抗体购自Cell Signaling Technology公司，RT-6500 酶标仪购自深圳雷杜生命科学股份有限公司。

1.3 实验分组 60只ICR小鼠随机分为对照组、模型组、地塞米松组(1 mg/kg)、低剂量广藿香酮组(40 mg/kg)、高剂量广藿香酮组(80 mg/kg)五组，各12只。模型组及对照组给予生理盐水灌胃，其他各组按照给药剂量进行灌胃。

1.4 COPD小鼠模型制备 采用反复香烟烟熏法复制小鼠COPD模型[12-13]，将小鼠放入自制的染毒箱(60 cm×30 cm×20 cm) 内，将香烟点燃后放入烟熏箱中。小鼠每天吸烟2次，上午下午各1次，每次30 min，1次10支烟，连续8周。从第5周起，在烟熏开始前1 h灌胃给药，每天1次，连续给药4周后处死小鼠。

1.5 血清IL-6、IL-1β、TNF-α含量检测 小鼠眼眶取血，1917 g 离心15 min 后取上清液于-80℃冻存备用。按照 ELISA 试剂盒说明书步骤检测血清中IL-6、IL-1β、TNF-α含量。

1.6 肺中SOD、MDA含量检测 冻存的肺组织按照重量(g) ∶体积(mL) =1∶9的比例加入生理盐水匀浆后，4℃ 1917 g离心10 min后取上清液冻存于-80℃备用。依据BCA说明书操作方法检测蛋白浓度，并按照SOD、MDA 试剂盒说明书步骤检测其含量。

1.7 肺病理学检查 小鼠肺组织在4%甲醛中固定24 h后常规石蜡包埋，切片及HE染色用于观察肺组织病理学改变。

1.8 蛋白印迹实验 将部分冻存的肺组织与预冷的蛋白裂解液及PMSF匀浆后，12 000 g，4℃离心15 min取上清。肺组织总蛋白浓度经BCA 法测定后，经10% 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离并用湿转法转移至PVDF 膜上。转膜结束后TBST洗3次；5%脱脂奶粉室温封闭2 h。封闭结束后将PVDF膜分别与Nrf-2、HO-1、p-IκBα、IκBα、p-NF-κBp65、NF-κBp65、GAPDH一抗(1∶1000)孵育，4℃过夜。在TBST洗膜3次，每次10 min后，加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗(1∶1000) 室温反应2 h。TBST 洗膜3次，每次10 min。ECL发光液显影，天能曝光仪曝光，quantity one测定主带的光密度值用于计算相关蛋白表达水平。

1.9 统计学分析 采用SPSS 20.0统计软件分析。计量资料比较采用t检验，计数资料比较采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 对肺损伤的影响 与模型组比较，地塞米松组和广藿香酮高、低剂量组小鼠肺组织中单核巨噬细胞为主的肺泡壁减少、肺内支气管炎细胞浸润减少，肺内支气管上皮中度变性坏死减少，杯状细胞化生减少，管腔内细胞或粘液阻塞减轻，管壁色素沉着减少，见图1。

A：对照组；B：模型组；C：地塞米松组(1 mg/kg)；D：低剂量广藿香酮组(40 mg/kg)；E：高剂量广藿香酮(80 mg/kg)。图1 广藿香酮对 COPD 小鼠肺损伤的影响(HE，×200)

2.2 对血清TNF-α、IL-6、IL-1β 含量的影响 与对照组比较，COPD 模型组小鼠血清TNF-α、IL-6、 IL-1β 含量增加，差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较，地塞米松组和广藿香酮高、低剂量组血清中 TNF-α、IL-6、IL-1β 的含量均降低，差异有统计学意义(P<0.05)；见表1。

表1 广藿香酮对 COPD 小鼠血清中 TNF-α、IL-6、IL-1β 含量的影响

注：与对照组比较，#P<0.05，##P<0.01；与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01；下同。

2.3 对肺中SOD、MDA含量的影响 与对照组比较，模型组小鼠肺组织中SOD含量减少，MDA含量增加，差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较，地塞米松组和广藿香酮高、低剂量组肺组织中SOD含量均增加，MDA含量均减少，差异有统计学意义(P<0.05)；见表2。

2.4 对肺中相关蛋白的影响 与对照组比较，模型组小鼠肺p-IκBα、p-NF-κBp65蛋白表达增加，Nrf-2、HO-1蛋白表达减少，差异有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，高剂量广藿香酮组能减少炎症相关蛋白p-IκBα、p-NF-κBp65的表达，增加抗氧化相关蛋白Nrf-2、HO-1的表达，差异有统计学意义(P<0.05)；见图2，表3。

A：对照组；B：模型组；C：地塞米松组(1 mg/kg)；D：低剂量广藿香酮组(40 mg/kg)；E：高剂量广藿香酮(80 mg/kg)图2 广藿香酮对COPD小鼠肺中相关蛋白的影响

表2 广藿香酮对 COPD 小鼠肺中SOD、MDA含量的影响

表3 广藿香酮对COPD小鼠肺中相关蛋白的影响

3 讨论

COPD 发病与吸烟和空气中污染物颗粒如 PM2.5、PM10、氮氧化物及硫氧化物等有密切联系，其机制主要是这些颗粒促使支气管内皮细胞处于持续性氧化和炎症环境中，即气道、肺实质及肺血管的慢性氧化应激和炎症。本研究通过香烟烟熏诱导构建COPD小鼠模型，建模结果与COPD 病理特征一致[13]。

研究表明[14]，炎症因子在COPD的气道炎症反应中起着重要作用，如IL-1、IL-6、IL-8、 IL-18、TNF-α、TGF-β和LTB4等。本研究结果显示，广藿香酮能减少COPD小鼠中TNF-α、IL-6、IL-1β的含量，提示其具有一定的抗炎作用。作为核转录因子，NF-κB广泛存在于真核细胞中，促进基因的翻译与表达。研究表明[15]，NF-κB信号通路在COPD的发生发展中起着重要作用，NF-κB与炎症反应、免疫反应和凋亡关系密切，激活NF-κB信号通路能增加TNF-α、IL-6、IL-1β的表达，进一步诱导炎症反应。本研究结果显示，广藿香酮能减少COPD小鼠肺中p-IκBα、p-NF-κBp65蛋白表达，提示广藿香酮可能是通过抑制NF-κB信号通路来抑制炎症因子的表达。研究发现[16]，COPD患者中慢性氧化应激能够诱导炎症的发生，进而诱导氧化应激；活性氧簇(reactive oxygen species, ROS)增加能减少粘膜功能，减少内皮细胞粘附和细胞外基质重建，ROS的增加能够激活NF-κB炎症通路。而Nrf-2/HO-1信号通路在抗氧化中起着重要作用[16]。本研究结果显示，广藿香酮能增加COPD小鼠肺中SOD含量，减少MDA含量，增加Nrf-2、HO-1蛋白的表达，提示广藿香酮具有一定的抗氧化作用。

综上所述，广藿香酮对COPD小鼠肺损伤具有一定的保护作用，其机制可能与抑制氧化应激诱导的炎症反应相关。