黑血动态增强磁共振成像技术对早期动脉粥样硬化炎性反应的可行性研究

董莉 申强 郭淼 李勐 张兆琪 陈慧军

动脉粥样硬化性疾病是威胁人类生命健康的“头号杀手”。研究表明，炎症在整个动脉粥样硬化斑块的形成、发展和最终到破裂导致心脑血管事件的过程中起着重要作用[1-5]。近期研究显示，利用动态增强核磁共振(dynamic contrast enhanced magnetic resonance imaging，DCE-MRI)可以对在活体动脉硬化炎性反应进行成像和定量分析，但仅限于对中重度动脉粥样化斑块的检测，对早期动脉硬化炎性反应的检测和定量分析方法仍需进一步研究。本研究基于DCE-MRI 原理，探索一种新的黑血动态增强核磁共振成像技术在定量测量早期动脉粥样硬化炎症反应的价值。

材料与方法

1.动脉粥样硬化模型建立 (1)3～4 个月龄，五指山小型猪20 头，雌雄不限(雄性已去势)，体质量(29.29±1.25) kg(自中国农业科学院畜牧所)。五指山小型猪20 头连续编号，高脂高胆固醇喂养(基础饲料+6%胆固醇+10%猪油)饮食。小型猪每日分2 次饲喂为避免动物突然喂饲高脂饮食出现应激反应，饲料量为体质量的3%，采取喂饲高脂饮食与基础饲料比逐渐增加的方法，10 d 后达到目标量。

(2)按照中华人民共和国卫生部实验动物管理规定执行(55 号文件，2001)，高脂饮食饲养，实验前24 h 禁食禁水。自达到目标量之日计算喂养4 周后，给予小型猪进行腹主动脉球囊拉伤术。以3%戊巴比妥纳30 mg/ kg 给予小型猪麻醉。麻醉平稳后经股动脉穿刺，用4 号穿刺针刺入动脉送入超滑导丝，造影下送入6F 直径球囊导管，连接手推式压力泵，将气囊充气自腹主动脉肾动脉水平(平腰3 ～4 椎体层面)向远段牵拉至髂动脉，造影下可见被球囊扩张的血管局部明显膨隆，每次30 s，间隔30 s，重复2～4 次，致腹主动脉内膜剥脱及机械损伤。撤出导管，按压止血。术后连续3 d 给予肌注青霉素200 万单位，以防止术后感染。

2.影像学检查 (1)MR 成像方法：扫描前24 h禁食，仰卧体位，使用表面线圈。所有检查在3.0T磁共振扫描仪 3.0 T (PhilipsAchieva，Best，the Netherlands)完成。线圈采用小动物专用表面相控振线圈。根据三维时间飞跃法血管成像(time-of-flight，TOF)(TR=21 ms； TE=2.9 ms； Flip angle=15°)判断血管位置。而后对血管壁(平腰3-4 椎体层面)进行二维黑血多加权MR 成像，成像序列包括：轴位T1WI(TR=800 ms； TE=11 ms； ETL=10)；T2WI(TR=3 500 ms； TE=40 ms； ETL=12)。黑血动态增强(black blood dynamic contrast enhanced magnetic resonance imaging，BB DCE-MRI) 扫描采用 T1WI FSPGR 序列(TR=750 ms； TE=12 ms； TI1=325 ms； TI2=125 ms，ETL=8)，矩阵 259×259；动态增强扫描相位数为15，扫描3 层面，层厚为3.4 mm。对比剂为马根维显(Bayer Schering Pharma AG，Berlin，Germany，0.05 mmol/kg)，经耳缘静脉注射，注射速度为1 mL/s，随后以同样流率注射0.9%氯化钠溶液20 mL。

(2)图像处理和分析：由两名经专业培训的影像科医生和影像学工程师阅读分析图像，应用分析软件CASCADE(美国华盛顿大学自行研发)[6]辅助完成。参与分析图像的工作人员对小型猪信息保持未知(盲法)并采取意见统一原则。根据血管壁图像质量评分标准，图像质量低(imagingquality，IQ＜2)认为无法分析，予以排除(表1)。通过软件，测量各层面管腔面积(lumen area，LA)、管壁面积(wall area，WA)、管壁标准化指数(normalize wall index，NWI)。计算血管壁容积传输常数(Ktrans)，血浆容积(Vp)，血管外细胞外容积(Ve)和曲线下面积(AUC)。

表1 图像质量判定的详细标准

图1 MR 图像和相关病理对照图 A：DCE-MRI 扫描动脉粥样硬化斑块可见强化(白色箭头)；B 和C：相应层面病理切片HE 染色显示动脉粥样硬化斑块内新生血管(黑色箭头)(B：HE 染色，×40；C：HE 染色，×100)

图2 MR 图像和相关病理免疫组化对照图 A：DCE-MRI 扫描，管壁可见不均匀强化(白色箭头)；B：IL6 免疫组化标记巨噬细胞，C：TNF 免疫组化标记巨噬细胞，棕色为阳性表达区域，蓝紫色为细胞核(×400)

3.病理免疫组化分析 模型制备成功后于2周、16 周分别处死实验动物以获得不同的炎症程度。取出腹主动脉至髂总动脉分叉处的主动脉，对扫描范围内血管进行固定(0.9%氯化钠溶液冲洗干净后，10%甲醛浸泡固定)。使用HE 染色观察血管的形态及动脉粥样硬化斑块形态。由于IL6 和TNF参与动脉粥样硬化斑块内的炎性反应，是巨噬细胞的主要介质[7]，免疫组化方法使用IL6 和TNF 染色标记动脉粥样硬化斑块内炎性细胞(巨噬细胞)。以细胞胞质内出现棕黄色颗粒且着色强度高于背景染色者判定为阳性。使用BA400 显微镜(摄像扫描装置：Moticcam 2306)对病理切片进行扫描，利用Image-ProPlus5.0 图像软件分析，计数每张切片400倍高倍视野下斑块内新生血管及巨噬细胞的数目。

4.统计学方法 采用SPSS16.0 统计软件进行数据分析。利用Spearman 相关分析，与病理微血管及巨噬细胞数目对照。计量资料以均数±标准差表示，采用t检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

结 果

1.模型建立 15 头五指山小型猪(15/20，75%)成功建立模型。死亡5 头小型猪原因：球囊拉伤术前麻醉过量死亡2 头；球囊拉伤术中误吸死亡1 头；球囊拉伤术后拉伤部位血栓形成致死2 头。另3 头建模成功的小型猪在建模后行磁共振扫描时(2 周 2 头、16 周 1 头)可疑药物(对比剂)过敏死亡。与模型建立前水平对比，建模成功后小型猪体质量显著增加[(29.29±1.25)vs.(46.86±6.87) kg，P=0.0007]。

2.影像与病理结果对照 与微血管数目比较发现，Ktrans 与其具有较好的相关性(r=0.913，P=0.0003，图1)。与巨噬细胞数目相比，Ktrans 亦与其具有较好的相关性(r=0.781，P＜0.0001，图2)。

3.影像结果 (1)模型建立前后血管形态学比较：与模型建立前比较发现，管腔变小[(72.35±10.72vs.(67.09±10.14) mm2，P=0.0003]，管壁增厚 [(1.10 ± 0.07)vs.(1.20 ± 0.13) mm2，P=0.0361]，标准化血管壁指数变大 [(0.0149 ±0.0019)vs.(0.0173±0.0018)，P＜0.0001，表2]。

(2)模型建立前后血管功能学比较：模型建立前、后比 较发 现，Ktrans [(0.0173 ± 0.0032)vs.(0.0307±0.0037)，P＜0.0001]、Vp[(0.0157±0.0041)vs.(0.0321±0.0122)，P= 0.0025]、Ve[(0.0988 ± 0.0229)vs.(0.1678 ± 0.0368)，P＜0.0001]，AUC[(11784±2013)vs.(18822±4948)，P=0.0057]数值均显著增高(图3)。

表2 模型建立前后血管形态学结果比较()

表2 模型建立前后血管形态学结果比较()

项目 模型建立前 模型建立后 P 值管腔(LA)/mm2 Max 76.83±9.76 71.49±8.68 0.0001 Min 67.12±7.66 61.82±8.32 0.0002 Mean 72.35±10.72 67.09±10.14 0.0003管壁(WA)/mm2 Max 1.19±0.08 1.39±0.14 0.0003 Min 0.80±0.06 0.91±0.08 0.0008 Mean 1.10±0.07 1.20±0.13 0.0361标准化血管壁指数(NWI)MaxNWI 0.0159±0.0028 0.0209±0.0037 0.0003 MeanNWI 0.0149±0.0019 0.0173±0.0018 ＜0.0001

讨 论

易损斑块与稳定斑块的增强曲线有很大不同，通过斑块不同的MRI 强化方式，有助于判断斑块的易损性[8-10]。DCE-MRI 灌注强度的定量值不仅反映斑块内新生血管中对比剂的强度，也同时包括了弥散至细胞外基质中的对比剂，从而引起对斑块内的新生血管密度的过度评估，若将该定量指标应用于临床，还需进行一系列相关实验得出其可靠的校正系数[11-12]。

从DCE-MRI 的动力学模型中可以得到一些反映血液供应和通透性的参数[13]。在以往亮血DCEMRI 的研究表明，动脉粥样硬化斑块内的浓度变化使用药代动力学模型进行分析所得到的灌注参数：分数血浆容量(fractional plasmavolume，Vp)与新生血管的面积相关[14]，而对比剂的转移常数(transfer constant，Ktrans)与新生血管的通透性相关[14]。证明Vp 和Ktrans 能够反应血管壁通透性和细胞外间隙，从而反映斑块内的炎性反应。Ktrans 值越大，则新生微血管数量越多，炎症反应越重[15]。然而，亮血DCE-MRI 对中重度的斑块可以进行测量，而动脉粥样硬化早期由于斑块负荷没有中重度的斑块负荷程度重，从而限制了其使用[16]。

图3 血管功能学比较图 A-D：炎性指标血管壁容积传输常数(Ktrans)，血浆容积(Vp)，血管外细胞外容积(Ve)，曲线下面积(AUC)模型建立前后变化

相对于亮血 DCE-MRI 技术而言，黑血 DCEMRI 具有以下优势：①去除血流信号对管腔边界的干扰；②较高的空间分辨率和信号噪声比[17]。Haikun 等研究发现，对亮血及黑血技术进行比较，发现黑血技术对管壁增厚不明显的血管可以测量Ktrans 指标，从而定量测量炎性反应的影像指标[17]。本研究使用新型黑血DCE-MRI，发现其检测指标Krans 与新生微血管数目及巨噬细胞数目二者具有较好的相关性。新生微血管是动脉粥样硬化易损斑块的重要病理学标志之一，而斑块内新生微血管的形成是由斑块内的炎症反应引起的[18-19]。有学说认为斑块内新生微血管是巨噬细胞进入纤维帽和斑块肩部的主要途径，斑块内的巨噬细胞、金属蛋白酶与内弹性膜的破裂和纤维帽胶原纤维溶解，增加斑块破裂和动脉血栓形成的风险[20-21]。处于活动期的动脉粥样硬化斑块新生微血管数目多，斑块内的炎性反应水平高。斑块炎性过程可以引起细胞外容积的增加和细胞内皮的通透性。新型黑血DCE-MRI 成像基于此特点，对比剂可以快速的进出斑块细胞外的空间，显像组织的微循环、灌注及毛细血管通透性的情况，有助于提高动脉粥样硬化易损斑块的检出和病变程度[22-23]。而且，新型黑血DCE-MRI 可以监测炎性反应的差异，可作为一种监测动脉粥样硬化炎性反应变化的无创性影像学指标。

本研究采用五指山小型猪的动脉粥样硬化模型，其管腔内径与人类的血管内径接近，可模拟人类血管的动脉粥样硬化。通过研究五指山小型猪模型建立前后血管形态学变化，发现与模型建立前比较，管腔变小，管壁增厚，标准化血管壁指数变大。这与人类动脉粥样硬化的演变相一致，今后能够作为人类动脉粥样硬化研究的动物模型。

本研究不足之处在于实验动物数量较少，动脉粥样硬化模型建立及核磁共振扫瞄时时实验动物病死率高。其原因主要包括实验中麻醉过量死亡，误吸死亡及血栓形成导致术后死亡。这些需在今后的模型建立中予以注意。另外，由于ktrans 所需的药代动力学分析中的血管输入函数无法直接测量，通过肌肉组织作为对照进行计算，有可能引入误差。最近的LaBBI 技术[17]可以同时采集黑血和亮血图像，有望可以获得更高的精度。

总之，黑血动态增强MR 成像方法可以反映早期动脉粥样硬化斑块炎症特征。并可以定量测量炎性反应的影像指标，为早期动脉粥样硬化提供了一种无创的影像监测手段。