不同植物配置下人工湿地微生物群落特征及其影响因素

赖巧晖, 张 浩, 刘治鹏

(1.广东农工商职业技术学院, 广州 510075;2.仲恺农业工程学院, 广州 510075; 3.广州市市政工程设计研究总院有限公司, 广州 510075)

作为一种污水处理方式，人工湿地又称为芦苇床系统构建湿地，于20世纪70年代兴起，是一种按一定比例融合了砾石、土壤、炉渣等物质后，并将其放入特定植被的一种处理污水的生态系统[1]。其作用原理在于，满足四大基本要素(水体、基质、水生植被和微生物)的基础上，通过化学、物理、生物等途径去除特定污染物[2-3]，已经被普遍运用于水环境富营养化和不同水体的水质净化中，取得了较好的经济效益和环境效益[4]。其主要优点为投资少、运行费用低、能源消耗少、经济美观等。通常情况下，在人工湿地填充沙和砾石等材料较多，但随着基质填料研究的深入，矿石及工业副产品等性能较高的物质也逐渐被纳入基质填料范围中，而针对沸石、白云石等混合基质的研究也在不断进行中[5-6]。除此之外，还开展了针对湿地植物的研究，发现灯心草、美人蕉、香蒲等植物都具备较强的净化污水的效果，都可以作为理想的湿地植物采用，而这些植物又具备较强的适应性和实用性，不仅生存较易，而且还具有相当程度的美感[7]。综合以上研究，作为一种高效环保的污水处理技术和生态化处理手段，人工湿地具有广阔的应用前景与空间。国外学界针对人工湿地的研究，大多集中在废水及污水处理方面，而我国学界对该方面研究并不深入[8-9]。尤其是运用于环境污染等领域，因此研究人工湿地在污水废水净化方面的作用和意义，对于人类的生存和发展具有重要作用。

土壤不仅是人类活动的载体，更是植物生长的载体，土壤微生物和活性直接影响作物的生长，进而对人类活动形成制约，土壤质量的重要标志就是肥力和活性，这也是近年来土壤研究的主要领域之一，其关乎植物生长的全过程，对生态环境起着不可忽视的制约作用[10]，是整个生态系统的重要组成部分，直接决定着生态系统生产力[11]。此外，土壤微生物的影响因素是多种多样的，其中微生物降解作用是不可忽视的，微生物一方面对地表腐殖质等进行降解使之成为土壤养分，另一方面自身的新陈代谢活动能够提升土壤活性，大大降低土壤板结等现象，有利于植被恢复和土壤稳定性保持[12-13]；微生物具有很强的环境敏感性，土壤变化能够及时作用到微生物活动中，说明微生物量具有周转快的特点[14-15]。作为陆地生态最活跃的成分之一，微生物在促进土壤养分循环方面作用显著，同时决定着矿物分解效果，其降解作用关乎整个生态环境的正常循环[16-17]。大量的研究数据发现，土壤养分与微生物群落的生长发育密切相关，同时微生物群落的分布也影响到土壤中氮、磷等相关营养成分，二者存在相互影响作用。因此，本文选择茭白(Zizaniacaduciflora)、鸢尾(Iristectorum)、菖蒲(Acoruscalamus)和芦苇(Phragmitesaustralis)4种人工湿地，研究不同植物配置下人工湿地微生物群落特征对环境的指示作用，其研究成果可为人工湿地的设计与生活污水的治理提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 人工湿地设计与流程

试验区选择华南农业大学的人工湿地系统，该系统将底部结构设置为集水区，并在上边放置尼龙网，其作用为防止填料下漏。将每个人工湿地划分为4个重复单元，总共16个人工湿地单元。湿地底部被划分为16个体积为长×宽×深=20 m×5.0 m×1.0 m的人工湿地结构单元，再用0.5 m宽的土埂将每个单元隔开，每个单元所填充的基质大致可分为三层，底层使用粒径为20—30 mm的大粒径砾石，设置的厚度为25 cm；中层使用粒径15—25 mm的当地中号炉渣，设置的厚度为25 cm；上层使用粒径为10—15 mm的当地小号炉渣和泥沙，厚度也为25 cm。在各湿地单元内，分别种植湿地植被鸢尾(Iristectorum)、茭草(Zizaniacaduciflora)、眼子菜(Potamogetonpectinatus)和菖蒲(Acoruscalamus)，一般保持3～7棵/m2的种植密度。在每个湿地单元中，还要将直径为10 mm的PVC管呈对角线埋入，以确保循环水从人工湿地中流入PVC管，方便采集试验样品。

1.2 样品采集

2013年5月，先将4种植被放置于微污染水中，驯化1个月后，开始净化试验。将鸢尾、茭草、眼子菜和菖蒲4种湿地植被进行株型和生物量趋同的选择后，栽种于用炉渣做基质的人工湿地上，添加自来水至基质饱和，再进行1个月的地下水培养，使其保持2～3 cm的薄水层，稳定20 d，中间换水3～5次。7月20日，经配水池向人工湿地缓慢注入生活污水，生活污水通过水管匀速流入，会通过布水管缓慢渗入，放水12 h后，停止注水，保持水力负荷控制在0.81 m3/(m2·d)。生活污水在人工湿地中停留大概48～60 h，水经过处理后从底部PVC管排出，再经过1 a的生长以后，测定各项指标。

当人工湿地稳定1 a后，2014年5月20日，在每个单元分别采集鸢尾、茭草、眼子菜和菖蒲人工湿地5株根区土壤(保留1 kg左右)，土壤样品数量总计90个，将表层的枯落物层去除，将土壤混合均匀后放入实验室进行分析和测定，之后在经过自然风干(20 d)、去除碎片和部分根后、过80目筛等流程，测定土壤养分，另一份要在室温4℃条件下保存，用以测定微生物群落多样性和微生物量，2014—2018年，选取5 a共计450个土壤样品，重复上述试验。

待人工湿地稳定1 a后，2014年5月20日分别采集茭草、鸢尾、菖蒲和眼子菜人工湿地根区土壤，每个单元采集5株根区土壤(保留1 kg左右)，共计90个土壤样品，除去表层的枯落物层，充分混匀后迅速带回实验室内分析测定，自然风干(20 d)去除碎片和部分根后过80目筛后测定土壤养分，另一份4℃保存测定土壤微生物群落多样性和微生物量，2014—2018年重复上述试验，5 a共计450个土壤样品。

1.2.1 土壤样品的测定 土壤的微生物量碳、氮、磷等成分测定将借助于氯仿熏蒸—K2SO4提取法，具体参考学者吴金水等[15]的测量步骤，碳、氮含量的测定分别借助于TOC2500碳分析仪、流动注射仪；磷的测量利用比色法；元素分析仪的使用能够测定全氮、全碳含量；速效磷、氮分别使用比色法、NaOH—H3BO3法；钾的测定利用光度计法[18]。

1.2.2 土壤微生物群落功能多样性 本研究采用Shannon，McIntosh，Simpson指数来衡量微生物群落特征；其对单一碳源的利用通过平均每孔颜色变化率AWCD来表示，该值较大的情况下说明微生物能够较大程度地利用碳含量，另一方面也说明微生物的丰度较明显，具体计算公式如下[15]：

AWCD=∑(Ci-Ri)/n

Pi=(Ci-Ri)/∑(Ci-Ri)

其中，培养基孔吸光值用Ci表示，对照孔吸光值为Ri；Pi为吸光的比值；n代表的是基孔数。

H=-∑Pi(lnPi)

Ds=1-∑Pi

1.3 数据分析

Excel 2010.0和SPSS 21.0进行数据统计和方差检验，所有数据为5 a的平均值，其中以平均值±标准误差表示(Mean±SE)，单因素方差分析(One-way ANOVA)，所有原始数据进行对数转换；变量的显著性经过的蒙特卡洛(Monte Carlo)检验(499次)，CANOCO 4.5软件进行排序分析。

2 结果与分析

2.1 不同配置人工湿地土壤养分特征

由表1可知，土壤有机碳、全氮、全磷、全钾、速效磷和碱解氮呈一致的变化规律，均表现为芦苇>菖蒲>茭白>鸢尾。其中有机碳变化范围为9.58～15.23 g/kg，均值为12.53 g/kg，芦苇和菖蒲差异不显著(p>0.05)，二者显著高于鸢尾和茭白(p<0.05)；全氮变化范围1.01～1.45 g/kg，均值为1.26 g/kg，不同人工湿地差异均显著(p<0.05)；全磷变化范围0.92～0.98 g/kg，均值为0.97 g/kg，不同人工湿地差异均不显著(p>0.05)，全钾变化范围16.58～23.06 g/kg，均值为21.25 g/kg，茭白和鸢尾差异不显著(p>0.05)；速效磷和碱解氮变化范围分别为25.17～32.69，13.11～19.57 mg/kg，其中芦苇和菖蒲显著高于茭白和鸢尾(p<0.05)。

2.2 不同配置人工湿地土壤微生物生物量

由表2可知，人工湿地对土壤微生物量有较大的影响，土壤微生物量碳、氮、磷呈一致的变化规律，均表现为芦苇>菖蒲>茭白>鸢尾。其中微生物量碳变化范围为321.47～423.03 mg/kg，均值为377.81 mg/kg，不同人工湿地微生物量碳差异均显著(p<0.05)；微生物量氮变化范围为75.36～123.59 mg/kg，均值为100.67 mg/kg，不同人工湿地微生物量氮差异均显著(p<0.05)；微生物量磷变化范围为13.25～19.03 mg/kg，均值为15.92 mg/kg，茭白和鸢尾差异不显著(p>0.05)，二者显著低于芦苇和菖蒲(p<0.05)；SMBC/SMBN大致表现为鸢尾>菖蒲>茭白>芦苇，鸢尾显著高于其他植物(p<0.05)；SMBC/SMBP大致表现为茭白>菖蒲>芦苇>鸢尾，其中芦苇和鸢尾差异不显著(p>0.05)；SMBN/SMBP大致表现为茭白>芦苇>菖蒲>鸢尾，茭白显著高于其他植物(p<0.05)。

表1 不同配置人工湿地土壤养分含量

注：相同小写字母表示差异不显著(p<0.05)。

表2 不同配置人工湿地土壤微生物量

2.3 不同配置人工湿地土壤微生物群落多样性

如图1所示，物种丰富度指数(H)、均匀度指数(E)、和碳源利用丰富度指数(S)均表现为芦苇>菖蒲>茭白>鸢尾，而优势度指数(Ds)则表现为鸢尾>茭白>菖蒲>芦苇。其中不同人工湿地碳源利用丰富度指数(S)差异均显著(p<0.05)，不同人工湿地优势度指数(Ds)差异均不显著(p>0.05)；对于物种丰富度指数(H)和均匀度指数(E)，芦苇和菖蒲差异不显著(p>0.05)，二者显著高于鸢尾和茭白(p<0.05)。

图1 不同配置人工湿地土壤微生物群落多样性

2.4 不同配置人工湿地土壤养分与微生物多样性的相关性

对不同配置人工湿地土壤养分和微生物多样性进行相关性分析可知(表3)，对于芦苇湿地，物种丰富度指数(H)与SOC，TN，TK，AN，SMBC和SMBN呈极显著的正相关(p<0.01)，与TP和AP呈显著的正相关(p<0.05)；均匀度指数(E)与SOC，TN呈极显著的正相关(p<0.01)，与TK，AN，SMBC和SMBN呈显著的正相关(p<0.05)；碳源利用丰富度指数(S)与SOC，TN，AP，SMBC呈显著的正相关(p<0.05)。对于鸢尾湿地，物种丰富度指数(H)与SOC，TN，TK，AN，SMBC呈极显著的正相关(p<0.01)，与SMBN呈显著的正相关(p<0.05)；均匀度指数(E)与SOC，TN呈显著的正相关(p<0.05)；碳源利用丰富度指数(S)与TK，SMBC和SMBN呈显著的正相关(p<0.05)。对于茭白湿地，物种丰富度指数(H)与SOC，TN，SMBC呈极显著的正相关(p<0.01)，与TK，AN，SMBN呈显著的正相关(p<0.05)；均匀度指数(E)与SOC，TN呈显著的正相关(p<0.05)；碳源利用丰富度指数(S)与TN，TK，AN，SMBC呈显著的正相关(p<0.05)。

对于菖蒲湿地，物种丰富度指数(H)与SOC，TN，TK，AN，SMBC和SMBN呈极显著的正相关(p<0.01)，与TP和SMBP呈显著的正相关(p<0.05)；均匀度指数(E)与SOC，TN，SMBC呈极显著的正相关(p<0.01)，与TK和SMBN呈显著的正相关(p<0.05)；碳源利用丰富度指数(S)与SOC，TN，AP，AN，SMBC和SMBN呈显著的正相关(p<0.05)。

表3 各土壤环境因子之间的相关关系(n=450)

注：**相关性在0.01水平上显著(双尾)；*相关性在0.05水平上显著(双尾)。

2.5 不同配置人工湿地土壤微生物群落多样性排序分析

本研究通过RDA排序分析来对群落多样性及环境因子之间的关系开展相应分析，这种分析方法可以同时对多个环境影响因子开展研究，毕竟影响微生物群落分布的环境因素存在多样性，通过这种分析能够对其与环境因子之间的关系开展多方面研究。本研究过程中的群落样方有限，因此将与前四轴无关的环境因子去除，之后再开展相应的分析研究。从表4可知，第一个排序轴的特征值根为0.616，与环境因子在0.01的检验水平下达到显著，相关系数达到0.946；第二排序轴的特征值根达到0.126，物种与环境因子显著正相关，且相关系数达到了0.568，前两个排序轴的累积解释度达到了92.7%，这说明排序是准确的，分析方法是正确的，则排序效果是满意的。

微生物群落分布受到多方面环境因子的制约，二者之间存在复杂的相互影响关系，具有很强的相关性，本研究过程中通过冗余分析来探究二者之间复杂关系。环境因子是微生物活动的影响载体，不同环境因子的综合作用会对微生物产生明显不同的影响，冗余分析方法正是基于多个影响因子下的关系分析，这种分析方法建立在多因素作用的基础上，将微生物群落分布作为响应变量，而养分、微生物量等作为解释变量，通过该分析方法找寻影响较大的环境因子。通过RDA排序分析不难看出，第一、二排序轴的解释度分别达到了56.3%，32.1%，并在0.05的检验水平下达到显著；通过试验分析得知，土壤养分能够显著正相关作用于微生物生长及其新陈代谢活动，微生物活动离不开必要的养分支撑，能够促进其生长发育等活动；从第一排序轴可以发现，有机碳及全氮显著影响微生物活动，成为影响其群落分布的最主要环境因子之一。

表4 典范对应排序轴特征值及解释比例

图2 湿地植被与环境因子的RDA二维排序图

3 讨论与结论

在自然情况下，因为生长环境的不同，湿地植物会形成不同生活型的群落。在净化污水过程中，植物群落种间会相互影响和作用，产生积极或消极的影响。不同植物群落类群由于自身种类和生长状态方面存在的差异性，形成不同的土壤微生物群落。而土壤微生物驱动和维持了人工湿地中的能量交换与物质循环，对生态系统的稳定性具有一定的促进作用[20]。本研究发现，在不同的空间配置前提下，4种湿地植物群落土壤有机碳、全磷、全钾、全氮、碱解氮和速效磷的变化规律一致，表现为鸢尾<茭白<菖蒲<芦苇。这说明菖蒲和芦苇具有极强的净化水质的作用，因为菖蒲和芦苇的根系比较发达，群落构成比较复杂，能够有效促进微生物的生长发育。而在不同的湿地中，植物自身的生长能力、提供氧气的能力、对污染物的吸收转化能力等都存在较大的差异性。不论是同一物种，还是不同物种，在不同的湿地中，往往表现出不同的净化功能[21-22]。所以，将湿地植物进行多种选择与搭配，不仅能够使植物之间产生优势互补的效果，还能保持对营养及有机物较好且更稳定的净化效果，从而保证湿地系统发挥稳定的生态功能。综上所述，与鸢尾和茭白群落相比，菖蒲和芦苇群落的生物多样性更高，净化效果更好，生态系统更加稳定，这说明科学合理的植物配置对环境的净化效果与系统生物多样性具有促进和提高作用[23-24]。

土壤质量不仅能够直接用土壤肥力、活性等指标进行衡量，同时也能根据微生物量来衡量，微生物量碳、氮、磷是重要的肥力指标反映之一[25]，这些成分能够被植被作为养分加以吸收利用，利于土壤肥力改善。从另一个方面来说，微生物量也是土壤质量动态变化的反映指标之一；微生物活性及结构受到多种环境因子的制约，单纯依靠微生物量难以充分反映其活性、功能等特性，但其绝对量也是重要的反映指标之一，且不同微生物成分的比例也是重要的影响因素；本研究中芦苇和菖蒲微生物量含量更高，进而促进物质代谢活动。相关性分析表明不同湿地微生物物种丰富度指数(H)与SOC，TN密切相关，通过RDA分析得知，该地区微生物群落分布具有一定的多样性，主要的影响因子不仅包括SOC，TN，还包括SMBC和SMBN，这些环境因子能够反映微生物群落分布，也能够对该地区生态动态变化予以反映，但群落分布与影响因子之间的作用机理有待于进一步深入探讨。