GS环保试剂在非小细胞肺癌EGFR基因突变检测中的应用

魁国菊,禹 乐,朱启淦,陈艺锦,杨立民,任红岳,孟加榕

*(联勤保障部队第九○九医院,厦门大学附属东南医院病理科,漳州 363000;*通讯作者,E-mail:Mengjiarong@sina.com)

肺癌是当前世界各国常见的恶性肿瘤之一。目前,肺癌不仅在欧美等发达国家居恶性肿瘤发病率及死亡率之首[1,2],也已成为我国城市居民死亡率第1位的恶性肿瘤,且有逐年上升的趋势[3]。近年来,肺癌又以非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)为主,约占所有肺癌的80%-85%[4]。传统治疗以手术、放化疗为主。2004年美国哈佛医学院的研究人员Paez[5]及Lynch[6]分别提出表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)发生基因突变的非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)对EGFR酪氨酸激酶抑制剂有高度敏感性。2016版的《中国非小细胞肺癌患者表皮生长因子受体基因突变检测专家共识》明确指出,所有NSCLC患者均应进行EGFR基因热点突变检测[7]。目前,检测EGFR基因突变的标本对组织固定、透明脱蜡制作石蜡切片和提取组织中DNA的脱蜡要求严苛,固定及脱蜡效果直接影响检测的结果,而传统脱蜡用的二甲苯为无色透明的液体,易挥发,有毒,长期使用有害身体健康,故寻找一种替代试剂用于组织脱蜡显得尤为必要,本研究旨在探讨使用GS环保脱蜡液替代二甲苯的可行性。

1 材料与方法

1.1 材料

选取联勤保障部队第九○九医院2017-10～2018-10临床送检肺癌标本,经HE染色和免疫组化确诊为肺腺癌病例16例,其中肺组织标本5例,肺穿刺组织标本6例,纤支镜标本5例。标本采用常规程序用二甲苯进行石蜡脱蜡处理检测获得EGFR基因突变阳性病例11例(19-Del病例5例,L858R病例5例,19-Del和T790M双突变病例1例),野生型病例5例。

1.2 试剂

核酸提取试剂盒(FFPE DNA，厦门艾德生物医药科技股份有限公司)；人类EGFR基因突变荧光PCR检测试剂盒(厦门艾德生物医药科技股份有限公司)；二甲苯替代试剂为GS环保脱蜡液Ⅰ、Ⅱ(哈尔滨格林标本技术开发有限公司)。

1.3 仪器

ABI 7500 Real Time PCR System(ABI公司);Amoydx-Giraffe紫外分光光度计SMA4000(厦门艾德生物医药科技股份有限公司)。

1.4 方法

1.4.1 DNA提取 根据福尔马林固定石蜡包埋切片(FFPE)组织面积的大小,刮取1-5片3-6 μm FFPE样品(同一标本切取2份蜡片厚度、片数一致样品)至1.5 ml离心管中,其中一份加入GS环保试剂脱蜡液Ⅰ 1 ml,振荡混匀10 s;室温12 800 r/min离心5 min,小心去除上清(勿吸到沉淀);加入GS环保试剂脱蜡液Ⅱ 1 ml,振荡混匀10 s;室温12 800 r/min离心5 min,小心去除上清(勿吸到沉淀);加入1 ml无水乙醇,振荡混匀10 s,室温12 800 r/min离心5 min,小心去除上清(勿吸到沉淀);室温开盖或37 ℃开盖放置,使乙醇充分挥发。再用核酸提取试剂盒(FFPE DNA)提取DNA。将提取好的DNA样品通过紫外分光光度计测定DNA浓度,将DNA浓度稀释至1.5 ng/μl,浓度低于1.5 ng/μl的样品直接取原液进行实验。另一份样品采用常规程序用二甲苯进行石蜡切片脱蜡处理做对照。

1.4.2 突变扩增阻滞系统(amplication refraction mutation system,ARMS)法检测EGFR 采用ADx-ARMS人类EGFR基因21种突变检测试剂盒,检测EGFR基因外显子18,19,20,21共21种权威机构提供的已知常见突变。

1.5 统计学方法

采用SPSS 15.0分析软件进行数据分析,两种方法提取的DNA合格率差异采用χ2检验,检验水准α=0.05,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 提取DNA合格率的比较

16例石蜡标本均采用GS环保试剂、二甲苯脱蜡,两者所提取的DNA合格率均为100%,DNA含量、质量差异无统计学意义(P>0.05,见表1)。

表1 GS环保试剂与二甲苯脱蜡标本DNA提取液的合格率的比较

Table 1 Comparison of qualification rate of DNA extract between environmental reagent GS and xylene dewaxing for the same paraffin-embedded specimen

试剂类型n合格不合格合格率(%)二甲苯16160100GS环保试剂16160100

样本DNA合格表示所获取的DNA样本浓度均大于2 ng/μl,DNA且蛋白质含量的比值OD260/OD280在1.6-2.2之间

2.2 EGFR基因突变状态结果比较

统计结果显示,16例石蜡标本,用GS环保试剂进行石蜡脱蜡处理检测获得EGFR基因突变阳性病例11例,其中19-Del病例5例,L858R病例5例,19-Del和T790M双突变病例1例,野生型病例5例,与用二甲苯脱蜡处理检测获得的EGFR基因突变结果完全一致(见表2)。

表2 二甲苯与GS环保试剂脱蜡同一标本的EGFR突变结果的比较

Table 2 Comparison of EGFR mutation results between environmental reagent GS and xylene dewaxing for the same paraffin-embedded specimen

试剂类型n19-Del突变(例)L858R突变(例)19-del和T790M双突变(例)突变率(%)二甲苯1655168.8GS环保试剂1655168.8

2.3 EGFR基因突变类型

16例用GS环保脱蜡液脱蜡的标本检测出的EGFR基因突变类型均与其二甲苯脱蜡的标本完全一致(见图1)。

A和B，C和D，E和F分别为同一石蜡标本图1 同一标本使用GS环保试剂与二甲苯脱蜡的EGFR基因突变类型对比Figure 1 Comparison of EGFR gene mutation types between environmental reagent GS and xylene dewaxing for the same paraffin-embedded specimen

结果表明,GS环保脱蜡液脱蜡效果好,能够代替二甲苯应用于非小细胞肺癌EGFR基因突变检测,并符合实验室环保的要求。

3 讨论

肺癌是当前国内外最常见的恶性肿瘤之一。目前推崇分子靶向治疗,EGFR突变状态是反映EGFR-TKI靶向治疗疗效的标志物,在进行靶向个体化治疗前必须进行EGFR基因突变的检测[8]。检测EGFR基因突变的标本以手术切除标本、活检标本为主,其组织固定、透明脱蜡制作石蜡切片和提取组织中DNA的脱蜡是进行肿瘤标本EGFR基因突变检测的基础,固定及脱蜡效果直接影响检测的结果。

由于二甲苯能很好地溶解石蜡,所以在病理组织制片过程中,二甲苯是首选的脱蜡剂。目前,大部分分子病理检查都是基于PCR实验进行的,由于PCR实验的本质是体外酶促合成特异性DNA片段,因此从石蜡包埋组织中提取优质的DNA显得尤为重要。二甲苯作为传统脱蜡液一直被广泛采用。二甲苯为无色透明有特殊气味的液体,是由间二甲苯、对二甲苯和邻二甲苯组成的芳香烃,具有高毒性,易挥发等缺点,既会对环境造成污染,又对中枢神经系统有麻醉作用,对眼及呼吸道有明显的刺激症状,可通过呼吸道吸入或皮肤接触进入体内后,能够引起神经系统和血液系统损害,长期接触还可引起神经衰弱综合征和植物神经紊乱以及皮肤黏膜刺激症状,甚至可造成免疫功能低下、贫血、白细胞减少、皮炎、湿疹和皮肤干燥,尿中也可以出现蛋白管型等[9],应尽可能避免使用。因此不少学者探讨用其他试剂代替二甲苯,较早有研究用松节油[10]代替二甲苯作为常规石蜡切片用脱蜡液,但是单纯的松节油透明和脱蜡效果远不及二甲苯,而且使用久了会变得黏稠。目前,国内外用无醛无苯环保试剂进行组织处理及制片的相关报道较多[11-15]。但在非小细胞肺癌EGFR基因突变检测方面的应用中,目前只查到陈志强等[16]报道的一篇。

为了克服二甲苯在使用中存在的上述不足,我们尝试使用一种无色、无味、非苯类无毒性的安全环保型脱蜡液替代二甲苯。本研究比较了GS环保脱蜡液和传统二甲苯的脱蜡效果,两者在提取DNA的合格率上均达到100%,并在此基础上进行EGFR基因突变检测,发现用GS环保脱蜡液脱蜡的标本检测出的EGFR突变状态与二甲苯脱蜡的标本一致,EGFR突变的类型显示出高度的一致性。实验结果表明GS环保脱蜡液可代替二甲苯应用于非小细胞肺癌EGFR基因突变检测,有利于实验人员的健康和环境保护,是一种值得推广、污染少的安全试剂。