不同产地罗汉果总皂苷、甜苷V和硒含量及指纹图谱研究

杨凤轩，李 刚，袁汉文*，夏祥华，夏 勉，周 琼

1广西民族大学 广西高校微生物与植物资源利用重点实验室，南宁 530006；2广西药用植物园，南宁 530023；3苍溪县国家现代农业示范区院士工作站，苍溪 628400；4广西大学农学院，南宁 530004

罗汉果(Siraitiagrosvenorii)是我国特有的传统保健药材，具有止咳、祛痰、润肺、降血糖、保肝、抗癌等多种作用[1-3]，是首批被国家卫生部公布的药食两用中药材[4]。研究表明，罗汉果中最主要的有效成分为葫芦烷型四环三萜皂苷类，以罗汉果甜苷V为主，是一类强甜味的非糖物质，其甜度是蔗糖的256～344倍，且其皂苷的苷键均为β键，人体不能将其分解消化[5]，食用后不会引起机体的血糖升高，属于“低卡路里食品”[6,7]。因此，罗汉果不仅有抗雾霾的开发潜力，还可作为药品、食品相关的功能产品为包括糖尿病和肥胖症患者等在内的广大人群食用，需求量日益增长[8]。

但传统中，罗汉果主要分布于广西、湖南等热带、亚热带地区[9]。随着罗汉果在各领域的应用不断拓宽，国内外市场需求不断加大，广西、湖南、四川等省份地区的罗汉果种植面积越来越广，考察控制不同产区果实品质，直接关系到罗汉果深加工产业的质量与发展[10]。

硒元素是人体必需微量元素之一，在人体内具有提高免疫力、防癌抗癌、抑制艾滋病、糖尿病等作用[11]。近年来针对我国广泛存在的硒的“隐形饥饿”问题，各地硒产业竞相发展，硒资源的开发利用迎来前所未有的热潮，但未曾有不同产区罗汉果中硒含量相关的系统研究报道[12]。

本文拟采用香草醛-浓硫酸分光光度比色法、高效液相色谱法和氢化物原子荧光光谱法对10个不同产地罗汉果总苷、甜苷V和硒进行含量测定，为罗汉果的推广种植、科研和开发利用等提供参考指导。

1 材料与方法

1.1 材料

罗汉果果实，取自四川、湖南、广西等9个地区(参见表3)，每个样品地区随机摘取15个成熟“青皮果”样品，统一经50 ℃烘烤至恒重，粉碎，混匀，过50目筛后置密封袋备用。

1.2 试剂与仪器

罗汉果甜苷V对照品，纯度≥ 98%(北京索莱宝科技有限公司)；硒标准品：浓度1 000 μg /mL，介质为10%盐酸(国家钢铁材料测试中心钢铁研究总院)。AB-8型大孔吸附树脂(天津市光复精细化工研究所)；乙腈为色谱级(美国Fisher公司)，硝酸、高氯酸、盐酸、氢氧化钾、硼氢化钾为优级纯，其余所用试剂均为分析纯，水为超纯水。

安捷伦1260高效液相色谱仪；色谱柱Alltima(TM)C18(4.6 mm × 250 mm，5 μm)752 N型紫外可见分光光度计；AFS-8220原子荧光光度计：配硒空心阴极灯；CEN微波消解仪：配聚四氟乙烯消解罐；EHD-12电热消解仪。

1.3 方法

罗汉果总甜苷、甜苷V及硒含量的测量具体方法如下述。首先对各指标的测量进行精密度、稳定性和重复性等方法学考察。然后，每个指标各样品均设三次重复，RSD < 10%。分别采用外标法，建立标准曲线，计算各指标的含量。对实验数据采用Excel进行处理，采用SAS软件进行差异显著性的方差分析和新复极差测验。

1.3.1 甜苷V的含量测定

甜苷V含量的测定方法根据《中国药典》(2015年版)[13]中罗汉果含量测定的高效液相色谱法。

甜苷V对照品的配制：精密称取罗汉果甜苷V标准品5 mg，置于25 mL容量瓶中，用乙腈-水(22∶78)溶液经超声溶解至刻度线，摇匀，得罗汉果甜苷V标准品溶液(0.233 6 mg/mL)，滤液经0.45 μm的微孔滤膜过滤，即得。

试样的制备：每个样品设置三个平行，加入甲醇加热回流两个小时，续滤液于旋转蒸发仪蒸干后用水溶解，AB-8大孔吸附树脂柱洗脱，收集洗脱液蒸干；残渣转移至10 mL量瓶中，加流动相定容，过滤，即得。

分别将甜苷V对照品与试样注入高效液相色谱仪进行测定，记录各峰面积，按外标法[13]计算含量。

1.3.2 总皂苷含量的测定

总皂苷含量的测定方法根据李锋等[14]香草醛—浓硫酸试剂分光光度计比色法。

总皂苷标准品的配制：精准称取罗汉果对照品5 mg配制成1.0 mg/mL的水溶液。分别精确吸取标准中间液100、150、200、250、300 μL，加水稀释到0.5 mL，再加入10%香草醛乙醇溶液0.5 mL。冰浴下加入75%硫酸5 mL。在恒温水浴锅中50 ℃加热20 min。在冰浴中冷却10 min，同时做空白试剂。

试样的配制：罗汉果粉于甲醇中浸泡12 h后加热回流6 h，上清液水浴蒸干；用水分洗涤并转移至AB-8型大孔树脂柱洗脱，收集醇液并蒸干；残渣以热水溶解于5 mL容量瓶中定容，后同标准品，作为供试品溶液。

1.3.3 硒含量的测定

硒含量的测定根据《食品安全国家标准》[15]食品中硒的测定，氢化物原子荧光光谱法测定。

硒标准品的配制：精确吸取1 mL硒标准溶液加入5%盐酸溶液配制成浓度10 μg/mL中间液。分别利用100 g/mL铁氰化钾与5%盐酸溶配制出硒标准系列溶液，质量浓度分别为0、1、2、4、6、8、10 μg/L。

硒试样的制备：微波消解法，罗汉果粉分别加入硝酸与过氧化氢，于微波消解仪硝化，后转入电热消解仪加热至近干，加6 mol/L盐酸溶液继续加热至澄清，加入2.5 mL铁氰化钾溶液(100 g/mL)，用水定容至10 mL容量瓶中，同时做质控和空白试样。

检测与条件：以5%盐酸溶液为载流，硼氢化钾碱溶液为还原剂(现配现用)，仪器条件为，光电倍增管负高压270 V，灯电流80 mA，载气流量300 mL/min，屏蔽气流量800 mL/min，原子化器高度8 mm，注入量0.5 mL。

2 结果与讨论

按1.3.1色谱条件，得到指纹图谱如图1，样品色谱图与对照品色谱图相应的位置上有相同保留时间的色谱峰，由此可确定甜苷V的出峰时间。

罗汉果甜苷V检测方法学考察结果表明，取同一供试品溶液，重复进样6次，RSD为1.39%(n= 6)，精密度良好；取供试品溶液置于室温下，分别于0、4、8、12、24 h进样10 μL，测定甜苷V吸收峰面积，计算RSD值为2.19%，表明供试品溶液在室温下放置24 h稳定；按供试品溶液制备方法将5号样品制备6个重复，依法测定，6个样品峰面积RSD为1.91%。

检测发现，以相同方式处理不同产地罗汉果，其色谱图有一定的相似度，但色谱峰的强度有明显差异，以各地区甜苷V的出峰面积为参量，利用SPSS软件做指纹图谱的聚类分析，结果如图二。不同产地罗汉果甜苷V含量可分为四类，第一类为2、5、6、7号样品，8、9号样品为第二类，1、4号样品为第三类，3号样品为第四类。说明不同产地相同品种罗汉果甜苷V含量具有一定差异，但与省份之间的关联不明显。

图1 罗汉果标准品与不同产地罗汉果样品指纹图谱Fig.1 Fingerprint of Siraitia grosvenorii standard and samples from different habitats注：a：罗汉果甜苷V标准品色谱图；b：9个产地罗汉果样品指纹图谱。Note:a:Chromatography of Siraitia grosvenorii Glycoside V standard;b:Fingerprint of Siraitia grosvenorii samples from 9 habitats.

分别将总皂苷标准系列在600 nm检测波长的紫外分光光度计中进行检测，以吸光值(abs)为横轴，以罗汉果皂苷量(μL)为纵轴，制作标准曲线为其中y= 59.683x-5.003 2，R= 0.999 39。

罗汉果总皂苷检测方法学考察结果表明，取同一供试品溶液，重复检测6次，RSD为1.26%(n= 6)，精密度良好；取供试品溶液置于室温下，分别于0、15、30、40、50、60 min进样10 μL，测定吸光度，计算RSD值为1.87%，表明，供试品溶液在室温下放置24 h稳定；按供试品溶液制备方法将5号样品制备6个重复，依法测定，6个样品吸光值RSD为2.61%，具有较好的重复性。

图2 不同产地罗汉果样品指纹图谱聚类分析图Fig.2 Cluster analysis for fingerprints of Siraitia grosvenorii samples from different habitats

按1.3.2方法测定总皂苷吸光度，将吸光值代入标准曲线计算各样品总皂苷含量。并进行罗汉果样品中甜苷V、总苷含量的差异显著性分析、多重比较，以及总苷中甜苷V占比计算，结果汇总如表1。

分别将硒标准系列导入原子荧光光度计测其荧光强度，以荧光强度为横坐标，质量浓度为纵坐标，得出标准曲线y= 0.020 12x+ 0.123 65，其中R= 0.999 99。

在相同条件下，将样品溶液分别按顺序导入仪器，质控样品在其范围之内，得出样品浓度并计算[15]硒含量，结果整理并经统计分析后汇总如表2。

表1 不同产地罗汉果甜苷 V 、总苷含量测定结果

注：差异显著水平P<0.05；不同字母表示多重比较的显著差异。

Note:Significant difference levelP<0.05;Different letters indicate the significance of the difference.

表2 不同产地罗汉果硒含量测定结果

注：差异显著水平P<0.05；不同字母表示多重比较的显著差异。

Note:Significant difference levelP<0.05;Different letters indicate the significance of the difference.

由表1可知，就甜苷V含量而言，湖南湘西回龙路果实中最高，其次是广西南宁西乡塘区，分别是1.42%和1.41%，湖南湘西龙山县茅坪乡的最低，为0.68%；就总皂苷含量而言，湖南怀化市辰溪县火马冲产罗汉果果实中含量最高，为3.34%，湖南湘西龙山县咱果乡土车村的最低，含量为2.42%；就总皂苷中甜苷V的占比而言，样品来源前面三位由高到低依次为：湖南湘西龙山县民安镇回龙路、广西桂林永福县龙江乡保安村、广西桂林市临桂区两江镇，分别为：56.48%、52.06%和49.34%，占比最低的是湖南湘西龙山县茅坪乡的果实，为28.03%。

近年来，随着罗汉果的种植、开发等相关产业的迅速发展，对罗汉果成分的测定和质量控制也日益受到重视。刘金磊等[10]分别采用紫外分光光度比色法和高效液相色谱法测定了桂北不同产地、不同品种罗汉果中的总皂苷和甜苷V的含量，总皂苷和甜苷V含量范围分别为2.45%～3.36%和0.81%～1.94%。周小雷等[16]建立HPLC测定罗汉果药材中罗汉果甜苷 V含量的方法，对不同品系罗汉果甜苷V的含量进行了测定，测得罗汉果甜苷V含量范围为0.25%～1.44%。本实验采用香草醛-浓硫酸分光光度比色法和高效液相色谱法对不同产地罗汉果总苷和甜苷V含量进行测定，甜苷V和总皂苷含量范围分别为0.68%～1.42%和2.42%～3.34%，接近前人的研究结果。广西、湖南、四川3个省份由南到北，纬度由低到高，但不论是总皂苷和甜苷V的含量，还是甜苷V在总皂苷中的占比，3个省份罗汉果果实样品之间没有表现出随纬度的差异显著性的规律性变化。

基因组和转录组研究[17-19]表明，大量基因参与罗汉果果实发育及品质形成，不同时期果实中分别有不同的中间代谢产物。由前述结果可知，尽管罗汉果果实发育时期一致，但总皂苷及甜苷V的含量不同，由于实验材料均为遗传背景相对一致的青皮果，造成这些差异的原因可能在于，不同产区温度、光照、肥、水等生长条件的差异导致果实生长期温光积累和营养条件不同，由于罗汉果皂苷合成进度不一致，因此，对于不同产区的罗汉果，宜根据品质要求进行抽样分析，以确定适龄的果实收获期。

由表2可见，湖南怀化市辰溪县火马冲的罗汉果果实中硒含量最高，其次是广西南宁市西乡塘区的和广西桂林市临桂区两江镇的，其硒的含量分别为41.462、32.696、32.373 μg/kg。邓卫利等[20]测定桂林山区种植的普通罗汉果硒含量为57 μg/kg，与本实验结果相近，而其培育的富硒罗汉果硒含量为109 μg/kg，远远高于普通罗汉果硒含量。沈丽水等[21]研究发现，不同地区种植中草药含硒量差异明显，如高硒区陕西省紫阳县产防风、益母草、淫毛藿、升麻、白芨五种中草药平均含硒3.38 mg/kg，而天水产这5种中草药平均含硒0.52 mg/kg，表明高硒土壤中生长的中草药含硒相对较多。本实验中不同地区罗汉果中硒含量并没有表现出省份间差异变化的规律性，但是各地区硒含量差异显著，表明不同土壤类型等可导致果实中的硒含量不同，因此，可通过改善种植区土壤硒含量等培育富硒罗汉果。

3 结论

由结果分析与讨论可知，在广西、湖南和四川等地，果龄相同时收获罗汉果果实，其主要品质指标总皂苷和甜苷V接近传统产区的一般调查结果，即总皂苷含量在2.42%～3.34%之间，甜苷V含量在0.68%～1.42%之间，罗汉果甜苷V可达到药典的0.5%的合格要求；不同产地间的罗汉果其总皂苷含量差异不显著而甜苷V差异显著，但这两个指标并没有表现出随纬度高低变化而在不同产地之间具有显著差异的规律性特征，其原因可能在于，具体产地罗汉果果实发育期甜苷合成代谢存在差异，与具体产地果期有效积温、水、肥、气等栽培环境条件不同有关，因此，应该根据年度气候条件和农艺管理等具体情况，通过抽样检测，建立合适的采收期，其具体影响还有待系统深入的研究。此外，本实验采用氢化物原子荧光光谱法首次对不同产地罗汉果硒含量进行测定，发现不同产地土壤条件下罗汉果中硒的含量具有显著差异，为富硒优质罗汉果的种植提供了参考。