山茶花花粉中稀土与重金属元素含量及花粉多糖的提取与生物活性研究

张 朵，闫荣玲*，罗志威，黄湘豫，闫江涛，廖 阳*

1湖南科技学院化学与生物工程学院 湘南优势植物资源综合利用省重点实验室，永州 425199；2秦皇岛市骨科医院，秦皇岛 066000

山茶花(Camelliajaponica)为山茶科山茶属植物，其花粉已被证明具有抗癌、抗氧化、抗衰老等多种生理功效，日常生活中常用作保健品[1-2]，食用花粉作为保健品时，在摄入所含多糖等活性物质的同时也摄入了不利于健康的稀土元素(rare earth elements，REE)与重金属元素(heavy metal element，HME)，在人体富集会导致代谢异常、神经传导受阻、机能亢进、组织损伤与病变等毒害效应[3-6]。因此，测定REE与HME在山茶花粉中的含量，评估其是否在对人体不会产生毒害效应的安全水平十分必要。植物花粉多糖具有增强免疫力、调节血糖血脂、抑菌抗病毒等生理功效，并已成为近年来研究的热点[1]，但目前还鲜见山茶花粉多糖提取及生物活性的相关研究报道[4]。提取得到花粉多糖是进行其生物活性测试的前提，而植物花粉的坚韧细胞壁会阻碍胞内活性物质的释出，导致传统的提取工艺往往次数多、耗时长、效率低[5,6]。因此消除花粉壁的传质阻力对提高花粉多糖提取得率十分关键。纤维素酶可通过水解细胞壁的主要成分纤维素使细胞壁变得疏松甚至破裂崩解；微波则兼具穿透力强和细胞破碎效果[8]。可见从理论上讲，纤维素酶与微波协同可在山茶花粉多糖提取中起到积极的辅助作用而提高提取效率和得率，当然这有待实验的证明。基于此，本研究测定了山茶花粉的所有种类REE及花粉中常见的部分HME含量，摸索建立了山茶花花粉多糖的纤维素酶-微波协同提取工艺，并分析了提取所得花粉多糖在增强机体免疫力与抗疲劳方面的生物学活性，以期为人们后续更好开发利用山茶花粉提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

山茶花采自湖南科技学院校园(经化学与生物工程学院黄国文博士鉴定为山茶科山茶属山茶花)，所采花朵花瓣无病虫害侵害迹象，且花瓣完整、鲜艳。采集的花朵及时带回实验室，剥离花瓣后平铺于培养皿烘箱中60 ℃烘干至恒重，过筛去除花丝等杂质并粉碎备用。

1.2 实验动物

50只清洁级3周龄昆明小鼠，雌雄各半，体重12.0～12.8 g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，动物合格证号SCXK(湘)2016-0002。

1.3 试剂与仪器

重金属元素标准液(国家标准物质中心)、稀土元素标准液(国家有色金属及电子材料分析测试中心)、硝酸(超级纯，苏州晶瑞化学有限公司)、纤维素酶(15 U/mg，上海博奥生物科技有限公司)、石油醚、浓硫酸、乙醇苯酚、氯仿、正丁醇(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)。

Agilent 7700电感耦合等离子体质谱仪(ICP-MS)，JP-300B高速多功能粉碎机，HH-4数显恒温水浴锅，UV-2800紫外光栅分光光度计，JY92-ⅡD型超声波细胞破碎仪，XH-MC-1微波合成仪，AB304-S型分析电子天平；RF52-A旋转蒸发仪；DGG-9053AD电热恒温鼓风干燥箱；低温高速离心机；YSI-1500乳酸分析仪。

1.4 重金属与稀土元素含量测定

采用密闭高压消解ICP-MS法进行重金属与稀土元素含量测定[12]。ICP-MS工作参数为功率：1 250 W；冷却气流速：15 L/min；辅助气流速：1.0 L/min；载气流速：1.10 L/min；采样深度：8.0 mm；分析模式：全定量。取适量重金属或稀土元素混合标准液，用5%稀硝酸稀释各稀土元素标准液配制成浓度为0、0.1、0.5、1.0、3.0、5.0、10.0 μg/L标准系列，然后将标准液分别注入电感耦合等离子体质谱仪，测定相应的信号响应值，绘制标准曲线。

称取花粉0.500 0 g置消解内罐中，加入5.0 mL浓硝酸浸泡过夜。盖好内盖后旋紧不锈钢外套，放入恒温干燥箱，160 ℃保持6 h，在箱内自然冷却至室温，缓慢旋松不锈钢外套，将消解内罐取出，放在控温电热板上于140 ℃赶酸，当内罐消化液约剩2.0 mL时加5.0 mL超纯水继续赶酸至2.0 mL左右，重复以上步骤直至赶酸完成。消解内罐放冷后，将消化液转移至10.0 mL容量瓶中(洗罐3次，合并洗液)定容，混匀后注入ICP-MS得到相应信号响应值(以不加样本的浓硝酸为空白对照)，根据标准曲线得到待测液中相应元素的浓度。平行测定3次，取平均值。

1.5 多糖最佳提取工艺的确定

1.5.1 多糖含量测定

精密称取干燥至恒重的葡萄糖40.20 mg置于500 mL 容量瓶中，加水至刻度后摇匀。分别吸取葡萄糖标准溶液0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 mL，各自以蒸馏水补至2.0 mL。加入5%苯酚1.0 mL后迅速加入浓硫酸5.0 mL，摇匀振荡室温放置20 min，482 nm处测定吸光度(以2.0 mL蒸馏水同样操为空白对照)。以葡萄糖质量、吸光度分别为横坐标与纵坐标，绘制标准曲线[13]。准确称取提取所得样本0.01 g，蒸馏水定容10 mL后，取其中2.0 mL按照上述步骤测得吸光度值，代入标准曲线方程计算出所提取多糖样品中的多糖含量(平行测定3次，计算平均值)。

1.5.2 提取流程

参考已有文献[14]，结合纤维素酶自身特性及前期预实验，确定提取过程中影响较小的3个因素，分别为料液比为1∶15、温度50 ℃和作用pH5.0。提取流程：称取山茶花粉末5.0 g，加入纯净水75 mL及一定量纤维素酶后于50 ℃和pH5.0条件下处理一定时间后置于微波合成仪中，在一定微波功率下处理一段时间后抽滤，所得滤液加入无水乙醇至终浓度90%，并于5 000 rpm下离心得沉淀。沉淀用蒸馏水溶解得粗多糖溶液，然后将多糖溶液与Sevag脱蛋白液按4∶1的体积比混合摇匀，离心收集上清液后再次加入无水乙醇至终浓度达90%，离心得沉淀，75%乙醇洗涤2次并真空干燥[5]。

1.5.3 单因素实验与正交优化

分别考察酶用量、酶解时间、微波时间、微波功率4个因素对山茶花粉总多糖得率的影响。酶用量分别设置0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.15 g/g，酶解时间分别设置40、60、80、100、120、150 min，微波时间分别设置5、15、25、35、45、55 s；微波功率分别设置100、200、300、400、500、600 W等6个水平。进行某一单因素实验时，其他因素保持不变，取酶用量0.06 g/g、酶作用时间80 min、微波时间25 s、微波功率300 W。根据单因素实验结果，选取各因素3个较好水平按照L9(34)进行正交优化，得到最佳提取工艺。

1.6 多糖生物学活性测试

1.6.1 抗疲劳活性测试

参考已有方法并稍作改良[15]：20只昆明小鼠适应性饲养7天后随机分为对照组、200 mg/(kg·d)多糖处理组，每组10只(雌雄各5；后同)。各组每天自由摄食和饮水，连续灌喂20天，处理组灌喂多糖溶液，对照组灌等量生理盐水。每次灌胃30 min后，各组小鼠分别置特定水箱中游泳2 min。每次水箱水深30 cm、水温30 ℃及放置位置等条件保持一致。末次灌喂30 min后，将小鼠置水箱中游泳60 min，分别于游前10 min及游后0、60、120、180 min鼠尾采血，用乳酸分析仪测定小鼠血液中乳酸含量。

1.6.2 免疫器官保护活性

昆明小鼠30 只适应性饲养7 天后随机分为正常对照组、免疫抑制组、多糖处理组，每组10 只。分别于分组后第3、5、7天对免疫抑制组、多糖处理组所有个体进行环磷酰胺(50 mg/kg)腹腔注射，正常对照组腹腔注射等体积生理盐水；并从实验第1天起，多糖处理组连续20天按照200 mg/(kg·d)的剂量进行多糖溶液灌胃处理，正常对照组与模型对照组则灌以等体积生理盐水。末次灌胃24 h后称体重并颈椎脱臼处死后取小鼠脾脏及胸腺滤纸吸干血迹后称重，通过脏器重(mg)与体重(g)比值计算胸腺指数和脾指数。

1.7 数据处理

数据经Excel 2003、SPSS 19.0进行整理与分析；使用Sigmaplot 10.0等软件进行作图。

2 实验结果

2.1 山茶花花粉的重金属与稀土元素含量

各稀土元素与重金属元素含量见表1。山茶花粉样本中稀土元素含量极低，所有种类的总含量为0.071 5 mg/kg；镧含量最多为0.020 1 mg/kg，其次有铈(Ce)、钕(Nd)、铕(Eu)，均超过了0.01 mg/kg；钇、钐、钆、镨、镱5种元素含量介于0.01与0.001 mg/kg之间；其余元素含量均低于0.001 mg/kg，且钷元素最少(0.000 6 mg/kg)，另有钬、铥、镥、钪4种元素未被检出。被检测的常见重金属铜、锌、镉、铅、汞、铬的含量也极低，其中铬(Cr)、汞(Hg)未检出，其他几种重金属元素的含量均高于稀土元素含量。

表1 山茶花花粉中重金属与稀土元素含量

2.2 山茶花花粉多糖提取最佳工艺

所考察各因素均对山茶花粉多糖得率有明显影响。在酶用量为0.02～0.06 g/g、酶解时间40～80 min，微波时间5～35 s、微波功率200～500 W范围内，多糖得率随着酶用量、酶作用时间、微波时间、微波功率的增加表现出逐渐增加的趋势，但在酶用量0.08 g/g，酶作用时间100 min，微波时间35 s，微波功率500 W后，多糖得率维持稳定。具体如图1所示。

根据单因素实验结果确定各自3个较优水平(酶用量0.06、0.08、0.10 g/g，酶作用时间80、100、120 min，微波时间25、35、45 s， 微波功率300、400、500 W)进行正交优化。结果发现，所考察的4个因素对山茶花粉多糖得率的影响大小顺序为：微波功率>微波时间>酶解时间>酶用量，最佳提取工艺为A2B1C3D3，即酶用量0.08 g/g，酶作用时间80 min，微波时间45 s，微波功率500 W(表2)，此条件下总多糖得率为2.69%。

图1 各因素对山茶花花粉多糖得率的影响Fig.1 Effect of various factors on yield of polysaccharide from C.japonica pollen

2.3 山茶花多糖生物学活性

如图2 A所示，泳前多糖处理组小鼠的血液中乳酸含量(14.12 mmol/L)弱低于对照组(14.24 mmol/L)，但无显著性差异(P>0.05)。游泳90 min后，两组小鼠血液中的乳酸浓度相对泳前均出现急剧增加，且对照组乳酸浓度高于多糖处理组；游泳结束进入休息阶段后，随休息时间的延长，两组小鼠的血乳酸含量均呈逐渐降低的趋势；休息180 min后，多糖处理组乳酸浓度已完全恢复到泳前水平(14.01 mmol/L，稍低于泳前浓度)，但对照组依然高于泳前水平。通过测定泳后两组小鼠乳酸浓度的变化率发现，不管是游泳刚结束时，血乳酸浓度较泳前的增加率，还是泳后不同时间节点较前一时间节点的血乳酸浓度减少率，多糖处理组均大于对照组(图2 B)。

表2 山茶花花粉多糖纤维素酶-微波辅助提取正交优化结果

图2 山茶花花粉多糖对血乳酸浓度的影响Fig.2 Effect of polysaccharide from C.japonica pollen on the concentration of blood lactic acid注：A:游泳前后血乳酸浓度变化；B:泳后不同时间血乳酸相对先前变化率。Note：A:Concentration changes of blood lactate before and after swimming;B:Rate of blood lactate change was different at different time after swimming.

分析山茶花粉多糖对免疫抑制小鼠胸腺及脾脏指数的影响发现，经过环磷酰胺(cyclophosphamide，Cy)处理的免疫抑制组小鼠的胸腺与脾脏指数均显著低于正常对照组(P<0.05)；而经过花粉多糖灌胃处理的小鼠，其胸腺与脾脏指数相对环磷酰胺抑制组得到显著提高(P<0.05)，但仍弱低于正常对照组(图3)。

图3 山茶花花粉多糖对免疫器官的保护作用Fig.3 Effect of polysaccharide from C.japonica pollen on the immune organ注：**代表P<0.05。Note:** indicated P<0.05.

3 讨论

植物花粉由于具抗氧化、抗衰老、抗肿瘤、益智造血等诸多功效而成为一种普及率高的保健品，但花粉中稀土与重金属元素在体内富集会导致智力下降、免疫异常、器官损伤等系列毒害作用[5,6]。因此测定花粉中稀土元素与重金属元素的含量可以评估其作为保健品食用是否有损人体健康[16,17]。本研究发现，被检山茶花花粉中稀土元素含量极低，部分元素甚至未被检出，所有17种稀土元素总含量为0.071 5 mg/kg，远低于2.0 mg/Kg的国家控制标准[18]；重金属元素中的铬与汞也未被检出，其余几种含量较稀土元素高但均未超出安全标准[19]。可见，山茶花粉中的稀土元素与重金属元素富集不明显，各元素的含量处于安全范围，食用山茶花粉作为保健品不会导致稀土元素与重金属元素在体内的大量富集而引发毒副作用。当然，本测定结果仅限所采样本，还需更多不同采集地山茶花粉测定数据的支持。

多糖是植物花粉中普遍含有的活性物质，近年已从油菜、马尾松、桂花、板栗等多种植物花粉中提取获得多糖，以期进行深入研究或产品开发[7,8,12,13]。花粉最外层的细胞壁是其活性物质提取的主要障碍，本研究借助纤维素酶与微波的协同辅助提取山茶花粉多糖，摸索建立了山茶花粉多糖的纤维素酶-微波辅助提取工艺。结果发现，酶用量0.08 g/g，酶解时间80 min，微波时间45 s，微波功率500 W条件下的提取得率可达2.69%。相对传统的水提醇沉等传统提取方法，经过纤维素酶与微波二者协同辅助下的多糖得率更高、时间更短、次数更少[8-10,20]。可见，纤维素与微波有效破坏了花粉的细胞壁，提高了多糖的释出速度与释出量，从而获得了更佳的提取效率与得率。

本研究对提取所得山茶花粉多糖的抗疲劳测试发现，多糖处理组小鼠运动结束时的血乳酸含量增加较对照组少；而进入休息阶段后，各观测时间节点小鼠血乳酸浓度衰减率多糖处理组均优于对照组。结果说明，山茶花粉多糖可有效减少运动中机体乳酸的产生量并提高运动结束后体液中乳酸的代谢速度，从而有效延缓机体疲劳进程并加快疲劳的消除速度，表现出良好的抗疲劳活性，这与人们在其他植物多糖的相关研究结果一致[9,15,21,22]。免疫活性测试中则发现花粉多糖处理组的小鼠胸腺与脾脏指数相对免疫抑制组得到显著提高，提示山茶花粉多糖除具有抗疲劳功效之外，还对免疫器官具有较好的保护作用。

综上所述，本研究通过测定山茶花粉中稀土元素以及有害重金属元素的含量确定了其处于绝对安全水平；建立了合理、省时、高效的山茶花粉多糖的纤维素-微波辅助提取工艺；发现了山茶花粉多糖良好的抗疲劳与增强免疫力活性。研究结果可为山茶花的综合利用与开发提供参考。

致谢：感谢永州市疾病预防与控制中心检验科唐融政主任等对本工作的支持与帮助。