脑微出血合并认知功能障碍的相关性因素及与血清IL-18的分析

于美玉，焦卓敏，张雪梅，李矜玥，欧阳元娇，李 薇，王 静

脑微出血(cerebral microbleeds,CMBs)在影像学方面被定义为颅脑磁共振图像(magnetic resonance images,MRI)的T2加权成像或磁敏感加权成像(susceptibility-weighted imaging,SWI)中直径小于10 mm的、圆形的或类圆形的、性质相同的病灶[1]。CMBs是脑小血管病变的一部分[2]。近年来随着我国老龄化社会的日趋明显及头部MRI及SWI的应用，CMBs被诊出率也越来越高[3]。CMBs的危害逐渐引起医学界的广泛重视。CMBs可引起记忆力下降、认知能力障碍(cognition impairment,CI)、姿势平衡障碍、情绪异常等临床症状。可能在一定程度上影响认知功能障碍的发生和发展[4]，有研究表明CMBs是老年人认知功能下降常见原因[5]。目前研究显示，CMBs与认知功能障碍有关，是血管性痴呆的主要危险因素[6]。CMBs在认知功能方面的意义引起了人们的广泛关注。

1 材料和方法

1.1 研究对象 分析2017年12月-2018年10月在哈尔滨医科大学附属第二医院接受诊治的脑微出血患者80 例 (男45例，女35例)，正常对照组40例(健康男性、女性各20例)。所有CMBs患者均经磁共振检查证实有CMBs病灶，所有健康对照组均经影像学显示为无明显异常。

入组标准包括：(1)患者18～85岁;(2)根据2014年《脑小血管病诊治专家共识》诊断为CMBs[7];(3)患者意识清醒;(4)行头部磁共振检查(包括MRI、SWI);(5)无先天性认知功能障碍;(6)临床资料相对完整者。

排除标准包括：(1)患者处于昏睡、昏迷或植物状态;(2)患者病情发展较快或伴有严重并发症;(3)患者存在严重语言功能障碍和/或双侧上肢运动功能障碍;(4)患者存在严重的视力和/或听力障碍;(5)患者存在严重精神障碍、身体虚弱或其他情况(如对测试不能耐受或不合作者等);(6)患有严重的脑积水、脑出血、脑外伤及脑手术病史;(7)患有脱髓鞘病、脑代谢疾病、脑肿瘤等疾病。

1.2 研究对象分组 A组诊断标准：(1)由患者家属提供信息或患者自身有认知功能衰退主诉者； (2)MMSE针对受教育年限认知功能障碍的划界分为：文盲组≤17分、小学组≤20分、中学或以上组≤24分；根据Lees等[8]、Salvadori等[9]不同荟萃分析将MOCA量表评分初步划分为：小学组及文盲组≤22分；中学或以上组≤26分。

B组诊断标准：(1)无认知功能衰退主诉者；(2)MMSE量表评分文盲组>17分、小学组>20分、中学或以上组>24分，或MOCA量表评分：小学组及文盲>22分、中学或以上组>26分；(3)认知功能总体表现正常者。 C组正常对照：门诊健康体检人群。

1.3 临床资料收集 入院第1天对所有患者进行问卷调查，问卷内容包括：性别、年龄、职业、吸烟史(吸烟年限、每日吸烟量、是否戒烟)、嗜酒史(每周饮酒天数、平均每天饮酒量、饮酒年限、是否戒酒)、高血压病史、糖尿病病史、高脂血症病史。所有患者入院36 h内于清晨空腹采静脉血行下列指标检查：空腹血糖、总胆固醇、血尿酸等。ELISA检测试剂盒主要用于血清IL-18指标水平的检测。接受诊治的患者72 h内行3.0T磁共振检查，MRI T1WI、T2WI及T2Flair、弥散功能呈像SWI横断位和T1WI矢状位扫描。对于已确诊CMBs患者进行认知功能量表测定，采用简易精神状态检查(Mini-Mental State Examination,MMSE)及蒙特利尔认知量表(Montreal Cognitive Scale,MOCA)对受试者的认知功能进行快速筛查量表的所有项目均由本院两位神经内科副主任医师完成。

1.4 实验室检查 (1)所有患者入院36 h内于清晨空腹采静脉血行下列指标检查：空腹血糖、总胆固醇、血尿酸等;(2)ELISA检测试剂盒主要用于血清IL-18指标水平的检测。ELISA检测试剂盒，方法如下：患者于入院72 h内采集血液，血标本置于EDTA试管内，2000 r离心10 min后取上清液，于-20 ℃冰箱冻存。使用上海优选生物公司提供的试剂盒、酶联免疫吸附法测定血清IL-18水平。设置标准品孔及样品孔，标准品孔各加不同浓度的标准品10 μl，血浆10 μl加入样本孔，分别再加稀释液40 μl稀释。除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的Klotho蛋白抗体100 μl，用封板膜封住反应孔，在37 ℃水浴锅或恒温箱温育60 min。弃去液体，于吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置1 min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次。每孔加入底物A、B各50 μl，37 ℃避光孵育15 min。每孔加入终止液50 μl，15 min内，在450 nm 波长处测定各孔的OD值。所有结果均重复检测3次。最后根据OD值计算浓度值，试剂均有原公司提供校验品，进行有效的质控。

1.5 头部磁共振检查 接受诊治的72 h内行3.0T磁共振检查，采用德国Siemens MAGNETOM Verio 3.0T MR扫描仪。所有患者行头部T1WI、T2WI及T2Flair、SWI横断位和T1WI矢状位扫描。T1WI参数： TR 450 ms，TE 15 ms；T2WI 参数：TR 4000 ms，TE 120 ms；T2Flair参数：TR 7000 ms，TE 120 ms；SWI参数：TR 86.20 ms、TE 43.90 ms。根据患者病情需要再行各相冠状位及矢状位(除T1WI外)扫描，层厚3～6 mm，层间距0.3～0.6 mm。脑白质病变的评估，根据MRI T2或T2Flair序列，采用Fazekas量表[10]对脑室旁和深部白质病变分别评分，两部分的分数相加计算总分(最低0分,最高6分)。脑微出血严重程度评估，采用微出血解剖评分量表(Microbleed Anatomical Rating Scale,MARS)，在T2加权的三维梯度回波序列计算CMBs数目(包括全脑CMBs、深部CMBs、脑叶CMBs以及幕下CMBs)。由经过培训的神经科医师、放射科医师各一名进行采用双盲法对所有影像资料进行分析，结果不一致时经协商后达成一致。

1.6 神经心理学的测评 对于已确诊CMBs患者进行认知功能量表测定，采用简易精神状态检查(Mini-Mental State Examination,MMSE)及蒙特利尔认知量表(Montreal Cognitive Scale,MOCA)对受试者的认知功能进行快速筛查量表均所有项目均由本院两位神经内科副主任医师完成。

2 结 果

2.1 CMBs患者一般临床资料分析 本研究共收录80例CMBs患者，男性45人，女性35人，正常对照组40例，男、女各20人。为了消除其他影响因素对试验结果的影响，我们对A组与B组中的年龄、性别、吸烟、饮酒情况、高血压、糖尿病及高脂血症发病率进行了比较分析，结果发现，年龄、性别、吸烟、饮酒情况、高血压、糖尿病及高脂血症发病率在两组间差别均无统计学意义(P>0.05)(见表1)。

2.2 CMBs组与影像学结果的关系 影像学显示侧脑室旁脑白质病变与CMBs合并认知功能障碍明显相关，且脑白质病变越重，认知功能障碍越明显，具有统计学意义(P<0.05)；CMBs数量与CMBs合并认知功能障碍明显相关，且数量越多，认知功能障碍越明显，具有统计学意义(P<0.05)。而CMBs部位及大小与CMBs合并认知功能障碍无明显相关性(P>0.05)(见表2)。

2.3 血清IL-18水平与CMBs及CMBs合并认知功能障碍的关系 CMBs组(A组与B组共同组成)中血清IL-18(72.44±14.38)pg/ml水平明显高于C组(50.07±22.02)pg/ml，且差异具有统计学意义(P值<0.05) (见表3)；A组IL-18水平(76.85±11.46)pg/ml高于B组(67.92±15.75)pg/ml，差异具有统计学意义(P<0.05) (见表3)。

2.4 CMBs组神经心理学测评比较 在MMSE量表显示，CMBs主要与定向力、注意力与计算力、回忆、语言明显相关，具有统计学意义 (P<0.05)，而与记忆力无明显相关，无统计学意义(P>0.05)。MoCA量表显示，CMBs主要与定向力、注意、语言、视空间与执行力、命名明显相关，具有统计学意义(P<0.05)。而与抽象、延时回忆无明显相关性，无统计学意义(P>0.05)(见表4)。

表1 CMBs组是否合并认知功能障碍患者基本情况比较

注：A组：CMBs组合并认知功能障碍组；B组：CMBs组无认知功能障碍组；P<0.05具有统计学意义

表2 CMBs是否合并认知功能障碍的影像学比较

注：A组：CMBs组合并认知功能障碍组；B组：CMBs组无认知功能障碍组；Fazekas评分：脑室旁和深部白质病变分别评分；SWI：磁敏感加权成像；CMBs：脑微出血；MARS：微出血解剖评分量表；P<0.05具有统计学意义

表3 CMBs组、CMBs合并认知功能障碍组与正常对照组IL-18水平的比较

注：A组：CMBs组合并认知功能障碍组；B组：CMBs组无认知功能障碍组；P<0.05具有统计学意义

表4 神经心理学的测评

注：A组：CMBs组合并认知功能障碍组；B组：CMBs组无认知功能障碍组；MMSE：简易智力状态量表；MoCA:蒙特利尔认知量表；P<0.05具有统计学意义

3 讨 论

3.1 CMBs患者临床基本资料分析 CMBs与腔隙性脑梗死、脑白质病变、血管周围间隙扩大都属于脑小血管病变疾病范畴，并且作为脑小血管疾病的一种影像学标志。目前大部分研究认为CMBs病变是血液成分的外渗，含铁血黄素及吞噬有含铁血黄素的巨噬细胞形成微小集合灶[1,11]。有研究认为脑动脉硬化导致脑微血管脆性增加[12,13]，极容易出血。也有研究认为在颅内血管发生闭塞，由于血流代偿机制也可造成患者出现CMBs性损伤。关于CMBs发病机制及发病危险因素目前尚无定论。有研究对部分导致CMBs发生的危险因素进行Logistic多因素回归分析，结果显示：CMBs的发生可能与高龄、性别、高血压病、2型糖尿病、淀粉样血管病、脑白质变性、血脂异常、服用抗血小板聚集药物、使用抗凝药物及吸烟等因素有关[14]。由于CMBs症状隐匿，不易被早期发现，但是一旦出现症状后常无法治愈，可能逐渐出现记忆减退、头晕、共济失调等轻度症状，尤其以短时记忆减退症状明显，一些隐匿性症状可能随时间逐渐加重，也可以随着每次脑卒中的发生而突然加重，甚至严重影响患者的认知功能。我们入组的CMBs患者分析结果显示影响CMBs发生认知障碍患者的年龄、性别、个人史等人口学资料及高血压、糖尿病、高脂血症等临床基本资料无明显相关性，这可能是由于我们的样本数据过少导致的。但是我们推测年龄、性别、个人史、高血压、糖尿病、高脂血症等危险因素也有可能是影响CMBs患者认知功能的相关危险因素。下一步需要扩大样本量进行研究。

3.2 CMBs与影像学的关系 大部分患者的CMBs病灶一般无明显临床症状，一旦出现可以察觉的症状，会大大降低对于疾病的控制效果，对于患者来说是一个随时潜在的危险，因此患者及时行影像学检查是非常必要的，不仅能够提高CMBs检出率，还对于CMBs患者的早期诊断、早期干预、早期治疗具有较大的临床指导意义。

目前临床上常用于MRI成像序列主要为T2梯度回波序列 (T2-GRE) 和磁敏感加权呈像(SWI序列)的扫描检查方式检测CMBs，尤其是SWI序列已逐渐成为检测CMBs的标准序列[1,3,15]。然而因其成像及后处理时间较长，因此大多数医院为不将SWI序列作为常规扫描序列。本研究为了更好的显示出CMBs的存在并且排除脑部其他疾病，如脑梗死、烟雾病、CADASIL等，患者除常规行MRI轴位T2WI序列外，还进行了SWI序列检查。由于MRI轴位T2序列对于脑白质病变更加敏感，本研究选择MRI轴位T2WI序列可观察脑白质病变的大小及程度，利用Fazekas评分[10](其中脑室旁和深部白质病变分开评分)对脑白质病变严重程度进行比较，T2WI序列虽然也可以显示出部分CMBs，但病灶显示并不完全，一些小的点状微出血灶甚至无法显示或者辨认，所以我们结合了SWI序列观察患者CMBs病灶情况，SWI序列扫描模式在对CMBs检查中不仅能够清楚显示微出血灶，而且在显示病灶的数目及直径等方面均显著多于或大于其他MRI序列，因为在人体内，血液常为顺磁性物质，当出现微血管变性出血时，红细胞被巨噬细胞吞噬导致含铁血黄素聚集，当患者出现CMBs时常有信号缺失，所以SWI对于患者CMBs检出率较其他检测手段检出率更高，可用于确诊CMBs，也为本研究的入组标准提供了可靠依据。我们的结果显示了侧脑室旁脑白质病变程度越重、CMBs数量越多，CMBs合并认知功能障碍程度越重。

3.3 CMBs与IL-18的关系 白细胞介素-18(IL-18)基因位于第11号染色体上，IL-18由巨噬细胞等诱导产生，属于促炎细胞因子，由IL-18基因编码的蛋白质广泛存在于人类中。IL-18存在于白细胞介素-1(IL-1)超家族的细胞因子，IL-18能够诱导产生严重的炎症反应，在某些炎性疾病中具有重要作用。有研究显示，IL-18促炎症作用下可以影响老年人的认知功能[16]。但目前关于IL-18与CMBs及CMBs合并认知功能障碍发生的临床研究罕见报道。本研究结果证明，IL-18水平越高，CMBs组明显升高，且在CMBs合并认知功能障碍组中更加明显。IL-18水平升高，不仅可以加重CMBs疾病发生，而且可以作为CMBs患者合并认知功能障碍影响程度重要指标。IL-18做为一种应激蛋白是能够诱导Th1细胞产生细胞因子同时促进NK细胞毒活性，促进T细胞增殖的物质，IL-18可以激活其他多种炎性因子，参与应激和多种免疫机制炎症反应过程[17]。因此IL-18的外周水平升高可能反映了疾病干扰中枢免疫相关稳态变化，有研究显示IL-18水平升高可能提示患者体内的神经细胞处于损伤状态，有局灶性或全身性炎症的发生，这意味着与患者体内的病变神经细胞的营养状态密切相关，还可能累及多种信号途径发生改变，如：下丘脑-垂体-肾上腺素轴等。患者在IL-18水平升高后，还可能表现出减弱对神经细胞损伤的修复能力，以及影响神经细胞的信号传递功能，这些均与IL-18的炎性作用直接密切相关。当IL-18进入神经系统后，一方面如果适度的IL-18炎性反应表达可以对于神经细胞内环境的维持与稳定具有一定的保护作用;另一方面如果炎性反应表达过度将影响正常神经细胞的成熟过程，正常神经细胞的成熟通常情况下需要炎性小体和转化酶的辅助和参与，所以炎性小体的成熟和活性大小对于保护、维持神经内环境正常功能或因其过表达导致损伤神经细胞内环境稳态与否具有关键性的作用[18,19]。IL-18可能更容易通过炎性小体发挥对神经细胞的损伤作用，导致神经系统功能的失调。有文献报道IL-18可以在一定程度上改变患者糖皮质激素及其受体的含量和表达水平，引起神经元功能和结构发生改变，这些改变共同促使CMBs的形成。因此在人体内高表达的IL-18可能是病变严重程度的重要客观指标，CMBs的形成有一定促进作用，可能是预示CMBs形成的客观指标。表明IL-18的水平升高对于导致患者认知功能障碍的鉴别与诊断方面是极其重要的。说明IL-18的升高很可能是造成CMBs患者出现认知功能下降以及出现相应病理结果的原因。

3.4 CMBs与认知功能的关系 CMBs患者影响认知功能的主要表现在对外界信息处理速度明显减缓、有效的注意力持续时间减少、语言流利程度显著降低等执行功能减退等症状，起病隐匿，症状进展缓慢。在认知功能障碍患者众多筛查量表中，简易智能精神状态量表(MMSE量表)简单易行，在国内外应用最为广泛，是筛查认知功能障碍及痴呆量表的首选，此量表中包含有视空间、定向力、计算力、语言、注意力、记忆5个方面内容，可以全面、迅速且准确地反映受试者的智力状况及认知功能缺损情况。MoCA量表注重对受试者执行能力的认知功能及注意力的评价，故本研究结合MoCA量表及MMSE量表筛查受试者的认知功能。

Seo等[20]在皮质下血管性痴呆的患者中研究了CMBs对多重认知域的独立影响，结果提示CMBs不仅能够影响执行功能，还对记忆、语言以及视空间功能有着同样的影响。本研究显示CMBs患者，在认知领域主要影响定向力、注意、语言功能。CMBs对于认知功能的影响已经明确，但是我们还需要进一步研究影响认知功能机制，才能更好的从根本改善CMBs带来的认知功能方面的影响。

总之，我们已经确定了许多CMBs合并认知功能障碍的相关性因素，对于CMBs合并认知障碍的影像学检查在临床实践中应充分发挥各种MRI序列的优势，如：联合应用SWI序列、DWI序列图像与常规MRI序列,用以排除小静脉、钙化、血管周围间隙、海绵状血管瘤、软脑膜含铁血黄素沉积的低信号的干扰，提高患者CMBs检出率和检出量，可以早期发现无症状CMBs，这对于患者CMBs合并认知障碍早期诊断、早期干预具有巨大帮助。并且研究了CMBs患者合并认知功能障碍的患者与血清IL-18之间的相关性，我们发现血清IL-18水平对于CMBs合并认知功能障碍的患者具有重要意义，此项结果可有利于加深临床上对CMBs的诊治认识，因而可依据上述研究结果排除不合理方案进而制定合理的诊疗方案，降低CMBs可能发生的风险。同时我们的研究显示IL-18的外周水平升高可能反映了疾病干扰中枢免疫相关稳态变化，这表明IL-18的升高对于导致患者认知功能障碍的鉴别与诊断方面是极其重要的，可作为对CMBs患者早期诊断认知功能障碍的生物学标志。而对于患者神经心理学的测评表明CMBs合并认知能力障碍的患者主要选用MoCA量表及MMSE量表筛查受试者的认知功能。结果显示在MMSE量表中，主要与定向力、注意力、计算力、回忆、语言明显相关，而与记忆力无明显相关。而在MoCA量表中主要与视空间与执行力、命名、注意、语言、定向力明显相关。而与抽象、延时回忆无明显相关，这对于临床诊断以及判断病情变化具有极其重要的意义，当然我们的实验因为时间及条件的限制还有很多的局限性,比如：加用其他量表可能将得到更加全面的数据评估，以及减少在量表评定中可能存在各式各样的误差，在控制变量上我们所选择的试验项目还应更加严格，对于其他学科的可能存在实验项目的交叉应该加以注意甄别，同时对于样本的数量如有必要还应继续收集，以增加试验组以及对照组的容量。但是我们可以预期，对于CMBs合并认知功能障碍的患者选择SWI序列、T2序列、MMSE量表及MoCA量表筛查以上检查方式以及上述结果能够提高临床医生对于患者的诊断准确性，并据此选择合理医疗方案，及时治疗患者疾病，延缓患者疾病发展，降低死亡率，值得临床大力推广。

该试验通过应用MMSE量表、MoCA量表评分对CMBs患者认知功能下降程度进行分组，并将CMBs患者中的IL-18进行单独研究，对比组间相关性因素、脑白质病变、CMBs的数量的差异，得出CMBs人群中，IL-18水平、侧脑室旁脑白质病变程度、CMBs数量与认知功能有关。CMBs人群中，人口学及高血压、糖尿病、高脂血症等危险因素对于CMBs患者的认知功能影响并不明显，但是我们也应当重视高血压、糖尿病、高脂血症对于CMBs患者的认知功能的影响。因此在临床上我们应重视CMBs对于认知功能的影响，及早干预从而减慢CMBs病变的进展。本研究样本量较小，可能导致结果不完全准确，需要扩大的样本量进一步研究验证。