美洲大蠊质量评价研究进展

邓雨娇，曾陈娟，马倩，许润春，马鸿雁*，耿福能

(1.成都中医药大学/中药材标准化教育部重点实验室/中药资源系统研究与开发利用重点实验室—省部共建国家重点实验室培育基地，四川 成都 611137;2.四川好医生攀西药业有限责任公司/药用美洲大蠊四川省重点实验室，四川 西昌 615000)

美洲大蠊PeriplanetaamericanaL.是蜚蠊科Blattidae大蠊属Periplaneta昆虫，与其他蜚蠊目昆虫均被称作蟑螂，因其生命力顽强为人们所熟知。在大多数人眼中，其能传播疾病、污染食物、造成过敏反应等，是令人闻之色变的卫生害虫，鲜有人了解其作为传统中药材的历史。美洲大蠊早在《神农本草经》就有入药的记载，后于《新修本草》、《本草纲目》等著作中均有记录，现代药学典籍如《中药大辞典》《云南省中药材标准》等亦有收录。美洲大蠊具有活血化瘀、清热解毒、消积、生肌的功能，现代研究表明其具有保肝、抗肿瘤、抗炎、增强机体免疫能力、促进组织修复等功能[1]，以其为原料开发的康复新液、心脉隆注射液、肝龙胶囊等在临床上应用广泛，效果显著。

全世界蜚蠊目昆虫众多，已知种类有4 600种，460个属，如美洲大蠊、黑胸大蠊、日本大蠊等，我国记载有6科260余种[2]。不少蜚蠊形态特征与美洲大蠊极为相似，容易造成混淆，从而出现掺假的现象，严重影响产品的质量，进而影响疗效，甚至产生不良反应，危及患者生命安全。同时，不同产地、不同饲养条件、不同采收炮制方法下的美洲大蠊有效成分含量也有差异，质量均一稳定难以得到保障。药材质量优劣会直接影响产品的临床疗效，而目前美洲大蠊鉴定、质量控制尚无统一标准，现有的质量评价方式专属性不强。现代技术的发展使得分析方法日新月异，以期为美洲大蠊质量评价带来新生机，结合传统与现代评价方法在完善美洲大蠊药材的质量评价体系中将发挥关键作用。

本文对美洲大蠊药材鉴别及质量评价方法、质量标准现状进行概述，分析质量评价体系中存在的问题并提出相应对策,最终构建出相对完善的美洲大蠊质量评价体系，为美洲大蠊药材质量评价提供参考和新思路。

1 美洲大蠊药材鉴别及质量评价方法

1.1 性状鉴别法

传统性状鉴别法是根据美洲大蠊药材本身表面特征来鉴别其真伪、优劣的方法，是最基本的方法，从古至今都有着广泛的应用。最早记录美洲大蠊入药的《神农本草经》中未见对其性状的描述，南北朝时期陶弘景在《名医别录》与《本草经集注》中分别对蜚蠊做了以下描述：“形似蚕蛾，腹下赤，即南人谓之滑虫也”[3]“蜚蠊，形似蛰虫而轻小能飞”[4]；唐代《本草纲目拾遗》中谓之：“状如蝗，蜀人食之”[5]；明代李时珍在《本草纲目》中有更为详尽的记载：“今人家壁间灶下极多甚者聚至千百，身似蚕蛾，腹背俱赤，两翅能飞，喜灯火光，其气甚臭，其屎尤甚。”[6]历代本草记载美洲大蠊形态大小有差异，但基本都是从其形状、颜色等来进行判别，为现代性状鉴别奠定了基础。现代性状鉴别多以体型、颜色、翅膀形状、前后胸背板形状、足、气味等为主，最主要鉴别要点为背板淡黄色至黄色，中部有黑色至棕褐色蝴蝶斑，其后缘中央向后延伸呈小尾，前缘有淡黄色“T”形小斑[7]。对于形态完整、特征明显的美洲大蠊药材，应用该方法可简便、快速、经济进行鉴别，但经过干燥及炮制后的药材翅、尾须等极易脱落,胸部特点也不甚清晰,无疑增大了鉴定难度。同时，性状鉴别主要依靠专业人员的经验进行判断，对鉴定人员要求高且主观性较强，较难实现客观化及批量化鉴别，使得该法具有一定的局限性。

1.2 显微鉴别法

显微鉴别法是利用显微镜对药材组织、粉末等进行观察，用以鉴别真伪、优劣的方法。美洲大蠊药材在炮制、储存、运输过程中极易破碎，仅凭外观形状难以准确鉴定，可借助该法对美洲大蠊药材进行分析鉴别。何文楷等[8]对15批不同来源的美洲大蠊药材粉末进行显微鉴别，可以明显观察到刚毛、足部、体表、翅部碎片，可与其他粉末进行快速区分，该方法为快速鉴别美洲大蠊提供参考。传统的显微鉴别法要求鉴定者掌握切片、制片、特征显微形态等专业知识，同时，对于粉末为超微粉时，该方法也具有一定的局限性。因此，需结合现代新技术如扫描电镜、显微摄影与计算机图处理技术等[9-10]，为美洲大蠊药材鉴别提供参考。

1.3 色谱法

1.3.1 薄层色谱法(TLC) 薄层色谱法利用不同成分在同一吸附剂亲和性的差异使得各成分分离的方法，具有操作简便、展开速率快等优点。该方法可快速分离脂肪酸、氨基酸、生物碱、核苷酸等物质，在美洲大蠊真伪鉴别及质量控制发挥了重要作用。李海波等[11]采用薄层色谱法对美洲大蠊药材中4种氨基酸(亮氨酸、丙氨酸、氨基丙酸、甘氨酸)进行定性鉴别，该方法斑点清晰、易于识别，为美洲大蠊药材鉴别与质量控制提供了有效的方法。张臻等[12]采用TLC法对美洲大蠊提取物进行研究，该提取物与对照药材均显示5个相同颜色的斑点，为美洲大蠊提取的质量控制提供参考。

1.3.2 高效液相色谱法(HPLC) 高效液相色谱法具有分析速度快、专属性强、重现性好等特点，在美洲大蠊有效含量测定及指纹图谱构建研究中也有着广泛的应用。肖培云等[13]建立了邻苯二甲醛柱前衍生化高效液相色谱法测定美洲大蠊药材中17种氨基酸成分的方法，并测定了不同养殖场饲养的美洲大蠊氨基酸含量，结果表明不同养殖场美洲大蠊药材各氨基酸含量与总氨基酸含量均有差异，为美洲大蠊药材质量评价提供参考。黄博等[14]采用HPLC法建立了同时测定尿嘧啶、次黄嘌呤、肌苷的方法，为完善美洲大蠊质量控制奠定基础。

美洲大蠊成分复杂，且功效众多，选取某一类有效成分进行质量控制只是一种过渡性手段，而指纹图谱技术具有“整体性”和“模糊性”属性，符合中药中多种成分、多靶点、多种机制共同作用的特点，突破了当前仅凭一种或一类成分为指标的“以点代面”的质量评价模式，为其整体质量控制提供新思路。王利春等[15]通过HPLC建立美洲大蠊药材及其提取物的指纹图谱，标定了11个共有指纹峰，可用于美洲大蠊中生物碱测定，也为其整体质量评价提供思路。吴红梅等[16]以肌苷为对照峰，建立了10批美洲大蠊HPLC指纹图谱，并通过共有峰的差异及是否含有特征峰，将美洲大蠊与黑胸大蠊区分开，可用于美洲大蠊药材鉴定及质量控制。指纹图谱虽包含了丰富的化学信息,但美洲大蠊中的有效成分多为氨基酸、蛋白质、多糖、多肽等，大多没有紫外吸收，不能完全包含有效成分。此外，只反映了其化学信息，未关联药效，难以表征其内在质量。因此，利用指纹图谱进行质量评价与控制有一定的局限性，但对完善其质量评价体系有着难以替代的作用。

1.3.3 超高效液相色谱法(UPLC) 超高液相色谱法原理与高效液相色谱法基本相同，但相较于HPLC具有分析速度更快、分离度更好、检测灵敏度更高的优点，可作为美洲大蠊药材及制剂质量控制的有效方法之一。郭昕等[17]建立了美洲大蠊乙醇提取物中原儿茶酸测定方法，为美洲大蠊相关制剂的质量控制提供借鉴。吴红梅等[18]建立了15批康复新液的UPLC指纹图谱，所有样品均可在23 min内完全出峰，相似度大于0.9，极大地提高了分析速率，为康复新液的质量评价提供了一种高效、快速的方法。

1.3.4 气相色谱-质谱联用技术(GC-MS) 气相色谱-质谱联用技术将色谱法高效分离的优势与质谱法准确鉴别的特点结合起来，在一些缺少明确对照品中药材的鉴定和质量控制中发挥了重要作用。在美洲大蠊药材质量评价中，GC-MS法常用于其油脂类成分的分析。罗建蓉等[19]利用GC-MS法分析了美洲大蠊药材中成分，共鉴定出35个成分，以油酸、亚油酸、棕榈酸、烷烃为主要成分。李江维等[20]对美洲大蠊原粉、去油粉末中油脂成分进行研究，二者油脂含量有较大差异，但主要都含有烷烃、脂肪酸及其酯类化合物。焦春香[21]对美洲大蠊醇提水溶性成分中的挥发性成分进行了研究，共鉴定出29种成分，以多元醇、有机酸、脂肪酸及其酯类为主，同时含有少量的生物碱类物质。

1.4 光谱法

1.4.1 紫外-可见分光光度法(UV) 紫外-可见分光光度法是利用溶液中分子或基团吸收紫外和可见光后产生电子能级跃迁而形成吸收光谱，用以定性和定量测定的方法，因其操作简单、测定速度快、准确度较高等优点，在中药含量测定领域得到了广泛的应用。李海波等[11]建立了UV测定美洲大蠊药材中总氨基酸含量的方法，为美洲大蠊质量控制提供依据。肖培云等[22]采用苯酚-硫酸法测定多糖的含量，建立了美洲大蠊药材中总糖含量测定的方法，为美洲大蠊药材的质量控制提供依据。肖培云等[23]以甘露醇为标准品，建立了美洲大蠊中甘露醇的含量测定方法，为其质量控制提供了实验依据。

1.4.2 原子光谱法 原子光谱法包括原子发射光谱(AES)、原子吸收光谱(AAS)、原子荧光光谱(AFS)，具有选择性强、灵敏度高、分析范围广等特点，既可测定中药中金属、类金属元素，又可间接测定某些非金属元素。张春妹等[24]利用原子荧光光度法测定云南省不同产地美洲大蠊药材As、Hg、Pb、Cd的含量，13批样品重金属含量均符合《四川省中药材标准》中对重金属限度要求，但不同产地药材各元素含量存在一定差异，该方法为美洲大蠊重金属残留量测定提供了有效方法，也为美洲大蠊药材临床安全使用提供了一定的参考。

1.5 电泳技术

该技术根据美洲大蠊中各成分相对分子量和所带电荷不同，因而在同一电场下移动速度和距离不同这一原理进行分离和鉴定的方法。美洲大蠊中含有多肽及蛋白质类成分，是其主要药效成分之一，具有抗肿瘤、免疫调剂、修护肝损伤抗氧化等作用[25-27]。电泳技术在美洲大蠊多肽、蛋白质的分离及分析方面有广阔的应用前景，可为其药效物质的分析与质量控制提供一定的参考。吴少辉等[28]初步探究了Tricine-SDS-PAGE法分离美洲大蠊小分子肽的方法，为美洲大蠊小分子肽的分离鉴定提供依据。张丹[29]利用十二烷基硫酸钠-聚丙酰胺凝胶电泳法(SDS-PAGE)分析了美洲大蠊冻干粉中小分子多肽的分子量，为美洲大蠊冻干粉质量标准的建立提供参考。

1.6 DNA条形码技术

DNA鉴定是利用基因组中一段公认的、相对较短的DNA序列来进行物种鉴定的一种分子生物学技术，根据不同物种基因碱基排列顺序不同来进行鉴别，是传统形态鉴别方法的有效补充[30]。麻锦楠等[2]对蜚蠊目10种共574个昆虫样本COI基因进行PCR扩增，并比较种间及种内遗传距离，结果表明种间遗传距离明显大于种内，说明DNA条形码技术可用于美洲大蠊物种的鉴定。有学者利用形态识别和DNA条形码技术将日本大蠊，德国小蠊，东方蜚蠊，美洲大蠊，侧缘蜚蠊和长须蜚蠊区分开[31-32]。DNA条形码技术为美洲大蠊的鉴别提供了更为准确、可靠、客观化的方法。

1.7 其他技术

氢核磁共振(1H-NMR)的代谢组学技术是利用1H-NMR对动物内源性代谢物进行分析的技术，具有分析速度快、适应性好、更加完整与系统等优点。耿福能[33]运用基于1H-NMR的代谢组学技术,同时测定了美洲大蠊及其提取物的整体化学成分，并鉴定出3个核苷(尿嘧啶、肌苷、次黄嘌呤)、12个氨基酸类化合物(谷氨酸、组氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、天冬氨酸、精氨酸、赖氨酸、缬氨酸、甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸)，建立了1H-NMR指纹图谱，为美洲大蠊整体质量控制提供参考。

2 美洲大蠊药材质量标准现状

美洲大蠊为传统中药品种之一，目前暂未被《中国药典》收录，仅被4个地方中药材标准收载，具体收载情况见表1。各省中药材标准对其性状鉴别存在差异，检查项选取和测定方式也不尽相同。其中福建省质量标准仅有性状鉴别，《湖南省中药材标准》《云南省中药材标准》对药材中丙氨酸进行了定性鉴别，而未进行定量研究，《四川省中药材标准》相对更加完善，除鉴别与检查项外，还对其中氨基酸含量进行规定，含总氨基酸以丙氨酸计，不得少于0.45%，另外还对其中重金属含量进行了限定。在各省中药材标准中，药效成分如核苷、肽类、多元醇类等成分未得到有效的定性及定量控制；易对人体造成危害的黄曲霉素含量、农药残留量也未进行限定。综上所述，美洲大蠊药材质量标准急需得到统一、提高、完善，从而保证药材质量，以保证其临床用药的安全性。

表1 美洲大蠊质量标准现状[34-37]

注：“+”表示此项检查已纳入中药材标准，“-”表示此项检查未纳入中药材标准。

3 美洲大蠊药材质量评价问题及对策

3.1 品种鉴别手段有待提高

品种鉴定和真伪鉴别是美洲大蠊药材鉴定与质量控制的首要任务，目前检查的鉴定方法未结合美洲大蠊自身特性，专属性较低。作为动物药，其鉴定方法不能照搬植物药和化学药品的方法，通过理化鉴别方法来进行，应考虑其特殊性，在传统物种分类的基础上，引入现代新方法新技术构建起专属性鉴定方法。

随着分子生物学技术的不断发展，分子鉴定技术的理论和方法在中药材鉴定领域得到了广泛的应用，该技术不仅能对完整的美洲大蠊药材进行鉴定，还能对其破碎的组织、粉末等进行准确的鉴定，可利用该技术，寻找美洲大蠊DNA片段序列中特异性位点，设计高特异性的鉴别引物，开发出分子鉴定试剂盒用以快速鉴别。此外，美洲大蠊作为动物药，其中含有大量的蛋白质与多肽类物质，此类物质是基因组在细胞水平的表达，因此，除了与同一或不同物种的共有蛋白质和多肽外，其组织器官中还含某些标志性蛋白和多肽，可利用表面增强激光解吸电离飞行时间质谱(SELDI-TOF-MS)片技术[38]或基质辅助激光解析附串联飞行时间质谱(MALDI-TOF/TOF-MS)技术[39]寻找美洲大蠊中所含标志性蛋白和多肽进行鉴别。综上所述，美洲大蠊药材的鉴别应在传统物种分类的基础上，结合现代技术建立起关键鉴别技术，实现精准、灵敏、快捷的药材品种鉴定和真伪鉴别方法。

3.2 内在质量评价方法有待改进

美洲大蠊成分复杂，大多为蛋白质、氨基酸、多肽等大分子物质，但药效物质基础不明确，作用机制不清晰。现有的美洲大蠊内在品质评价依旧拘泥于找成分、测成分的模式，缺乏对其专属活性成分的寻找与评价，评价方式也缺乏专属性，使得美洲大蠊质量评价进展缓慢，难有突破。因此，深入开展美洲大蠊药效物质基础研究，寻找其中特异性有效成分，并建立化学成分与药效间的关联是进行质量控制的基础。结合动物药自身特点，在评价美洲大蠊内在质量时，可引入现代生物评价技术和方法对其进行质量控制。如利用生物活性检测，建立与其功效或毒性相关联的生物评价方法；应用高内涵分析、组学生物标志物等技术，建立与其作用机制相关的评价方法。最终构建以生物评价为主，辅以化学成分定性及定量、指纹图谱的内在质量评价方法。

3.3 安全性评价体系有待完善

美洲大蠊属于动物药之一，传统中医谓之“血肉有情之品”，在临床使用中发挥其独到的疗效，但其中油脂、蛋白质、重金属等存在潜在危害，因此安全性评价也是不容忽视。美洲大蠊安全性评价中，仅对其重金属含量进行了限定，其他外源性物质，如农药残留量、黄曲霉素含量、二氧化硫残留量等均未得到相应控制。除外源性物质，内源性物质如油脂、蛋白质等具有潜在安全性问题的成分也未加以控制。有研究表明美洲大蠊油脂对于肝损伤小鼠具有毒副作用，可能与其中棕榈酸有一定关系，若以全粉入药会加重肝功能不全者的肝损伤。蛋白质的过敏原蛋白为Pera 1-Pera 10，其中Pera 9为主要过敏原之一[40]，会引起IgE介导的I型超敏反应从而损伤机体。但油脂类成分具有抗氧化、抗癌、抑菌等功效[41-43]，油脂中不饱和脂肪酸可防治心血管疾病，亚油酸可降低血脂从而防止动脉粥样硬化等[44],蛋白质具有抗肿瘤、免疫调剂作用、修护肝损伤抗氧化等作用。油脂与蛋白质既是药效成分又有潜在安全隐患毒，如何将美洲大蠊油脂成分含量控制在安全有效的范围内，是美洲大蠊安全性评价的关键问题之一。外源性与内源性物质含量需加以控制，共同构建起美洲大蠊安全性评价方法，从而保证临床用药的安全可靠，这对完善和提高美洲大蠊质量评价体系也至关重要。

4 结语

美洲大蠊作为传统中药材，已有上千年应用历史，在临床上有其独特疗效，国内外学者及大众的关注日益增多，但目前尚未见统一的质量标准，也未见完善的质量评价体系来控制其整体质量，安全性、有效性、药材的均一稳定性难以保证，因此完善并提高其质量评价体系迫在眉睫。美洲大蠊质量评价体系的建立应从品种鉴定、内在质量评价和安全性评价三方面着手，融合传统评价方式与现代技术，形成科学有效的质量评价体系，必将进一步推进美洲大蠊药材质量评价的科学与有效性，给临床用药的安全性、有效性提供保障。