微生物转化技术在中药资源开发中的应用研究

马逢时，刘家水，谈永进

(安庆医药高等专科学校 药学系，安徽 安庆 246052)

中药资源是我国的民族瑰宝，也是中华民族的国家战略资源[1-2]。中药资源的研究已有千年历史，药学研究者们致力于从中药资源中寻找高效、安全的药物成分。随着中药现代化进程的加快，中药资源的利用率得到一定的提高，各种现代科学技术也逐渐引入中药资源的开发利用之中，进一步促进了中药的发展[3-6]。

将微生物转化技术与中药资源相结合，可以解决中药资源水溶性差、毒性强、活性低、资源匮乏等问题，微生物转化技术是推动中药资源开发、中药现代化的重要途径[7-8]。微生物转化反应条件温和、特异性较强、转化产率较高，且绿色无污染。应用此技术(主要是转化体系中产生的酶系)对已存在天然中药资源进行转化，相比传统化学方法更高效，同时能够在一定程度上模拟药物代谢，从而获得更多新的活性化合物[9-11]。微生物转化技术包括环氧化、脱水、加脱氢、酯化以及糖基化等反应，与传统中药活性成分研究方法相比，在转化速度和转化质量等方面均表现出了显著优势，在中药资源开发应用中具有广阔的前景。在新药开发以及药物代谢研究等方面均需要以对微生物转化技术的应用为支持。

1 微生物转化应用于中药的优势

微生物转化技术的本质是利用微生物所产生的酶以外源性的中药化合物作为底物进行结构转化的过程。相比传统化学转化而言，微生物所催化的反应是很多化学合成难以进行的反应。随着当代生物技术的发展，中药的微生物转化研究中引入溶剂工程、诱变和基因重组等新技术，这为新的活性中药衍生物提供更多的可能性。微生物转化特点，见表1。

表1 微生物转化中药的优势

2 微生物转化对天然药物资源应用

2.1 皂苷类资源微生物转化

皂苷类化合物具有中枢神经系统作用、抗肿瘤作用、抗炎、抗过敏、抗菌、抗病毒、降胆固醇及心血管活性等药理活性[12-13]。研究表明微生物转化法可有效改变皂苷糖链结构，提高皂苷的生理活性[14-15]。对于皂苷类的微生物转化，研究最多的是人参皂苷[16]，Quan等[17]利用从韩国传统发酵食品泡菜中分离出的类消化乳杆菌LH4 (LactobacillusparalimentariusLH4)将人参皂苷Rb1转化为药理学活性更强的CK。以TLC，HPLC和NMR分析酶反应，类消化乳杆菌LH4无细胞酶在30 ℃、pH 6.0反应72 h的最佳条件下，1.0 mg/mL的人参皂苷Rb1转化得到0.52 mg/mL的CK，具有88%的摩尔转化率。无细胞酶水解人参皂苷Rb1的C-3和C-20的两个葡萄糖基。人参皂苷Rb1的水解途径为：人参皂苷Rb1→股蓝总苷XVII和人参皂苷Rd→人参皂苷F2→CK，类消化乳杆菌LH4具有应用于工业制备CK的潜力。利用微生物刺囊毛霉菌对20(R)-人参二醇进行转化共分离鉴定出了5个化合物，对抑制HSC-T6细胞增值的作用也增强[18]。Lee[19]通过比较新鲜红参以及发酵红参(微生物菌株与不加入微生物菌株)中20种人参皂苷含量的变化，研究发现，相比新鲜红参，红参发酵后，人参皂苷Re、Rg1和Rb1含量下降，但是人参皂苷Rh1、F2、Rg3和CY的含量增高，而且加入微生物菌株进行发酵后酚类物质和还原糖的含量最高。菌株S329属于溜曲霉(Aspergillustamarii)，人参皂苷Re转化人参皂苷Rh1的转化率为27.65%[20]。目前人参大多采用口服给药，以传统方法明确其体内肠道代谢过程具有一定的困难性，采用微生物转化技术模拟体内代谢过程对明晰药物疗效和作用机理有很大意义。

此外，应用微生物技术转化绞股蓝皂苷[21]、积雪草皂苷[22]、薯蓣皂苷元[23]、和芍药苷[24]、连翘苷[25]、虎杖苷等[26]，以提高其皂苷含量、发现新化合物和提高作用效果的研究也多有报道。

2.2 黄酮类资源微生物转化

黄酮类成分在体内外具有不同的生物活性，但是由于天然黄酮资源限制以及混合物分离的难度，黄酮类成分的研究受到限制，应用微生物技术转化天然黄酮产物是目前黄酮类成分研究的新方向[27-28]。Jones等[29]通过大肠杆菌复合羟化酶HpaBC将柚皮素高效转化为圣草酚，此外HpaBC能够高效转化各种邻羟基黄酮类化合物和黄酮类衍生物。肠道菌群可能存在能够将大豆苷元转化为雌马酚的细菌，雌马酚比大豆苷元生物学活性更强[30]。利用外源菌株改变大鼠雌马酚产生能力，拟杆菌门细菌在转化过程中起着十分重要的作用[31]。Parajuli等[32]在大肠杆菌BL21(DE3)发现区域专一糖基转移酶，其能转化非瑟酮得到非瑟酮-3-O-葡萄糖苷和非瑟酮-3-O-鼠李糖苷，转化率高达99%，另外大肠杆菌BL21(DE3)转化槲皮素、山萘酚、杨梅素等黄酮醇到各自糖苷的转化率达到95%以上。Wang等[33]从南京土壤中分离得到CGMCC 4913，其在10%乙醇条件下将葛根素转化为7-O-果糖苷的葛根衍生物，转化率达97.6%，其衍生物的水溶性和抗氧化活性得到较大改进[34]。

多甲氧基黄酮 (PMF)是主要活性黄酮，它表现出抗癌、抗氧化损伤等多种生物活性。Kim等[35]首次以活性为向导筛选PMF代谢相关的人体肠道细菌来研究PMF的生物转化和体外表征，最终筛选出Blautia属MRG-PMF1菌种，MRG-PMF1将PMF代谢至对应的去甲基化黄酮，其中5，7-二甲氧基黄酮和5，7，4’-三甲氧基黄酮分别代谢为5，7-二羟基黄酮 (白杨素)和5，7，4’-三羟基黄酮 (芹菜素)，C-7位甲氧基优先水解。此外，MRG-PMF1还具有去糖基化活性，转化生成相应的糖苷配基，该菌株的发现对于我们了解黄酮类化合物在人体肠道代谢过程以及发现新的生物活性黄酮化合物具有很大意义。微生物发酵处理方法可以改善酚酸、黄酮含量以及清除自由基的能力。比较芽孢杆菌菌种发酵、烤、蒸等工艺后菝葜叶的总酚酸和总黄酮的含量，结果表明微生物发酵过后菝葜叶的总酚酸和总黄酮含量显著提高，尤其是酿酒酵母和米曲霉发酵过后氧自由基吸收能力最高[36]。雌性啤酒花球果广泛应用于酿造工业中，目前研究发现其对于制药工业也有较大的应用价值，啤酒花含有大量黄酮类成分，其具有抗癌、抗氧化、抗微生物、抗炎和雌激素作用。尤其啤酒花球果黄酮类化合物的生物转化以及在胃肠微生物群相关的微生物酶促反应实现了该黄酮类成分的催化和转换，所得转化产物在制药工业中具有很大的应用潜力[37]。

鉴于异黄酮及其相关糖复合物在人类健康的重要作用，对于其酶促转化引起药学工作者相当大的兴趣。You等[38]将乳双歧杆菌AD011中的β-葡萄糖苷酶基因转载至两歧双歧杆菌BGN4中，构建β-葡糖苷酶的活性和热稳定性高表达的重组两歧双歧杆菌B919G菌株，B919G粗酶提取液能在4 h内转化黄豆苷和染料木苷，其菌体本身转化豆奶中黄豆苷和染料木苷也可在6 h内完成，相比D011转化效率更高。B919G菌株的构建能将豆奶发酵产生更高价值的异黄酮类成分，同时也保留了本身益生菌的功效。Du等[39]也从新鞘氨醇杆菌GX9中分离得到一种新颖的β-葡糖苷酶，对黄豆苷和染料木苷的水解活性很高。革兰氏阴性厌氧微生物MRG-1显示去糖基化和还原黄豆苷的高活性，能定向转化异黄酮、大豆苷元、染料木素、羟基异黄酮和芒柄花素，产生相应的黄酮衍生物[34]。由于对食品安全和环境问题，黄酮类化合物生物合成的安全、廉价和基质可再生性问题正日益引起人们的注意。Wu等[41]对L-酪氨酸合成(2S)-柚皮素的合成途径进行优化以及从D-葡萄糖合成(2S)-柚皮素的异源途径的构建，提高了在大肠杆菌中合成(2S)-柚皮素的合成效率，实现了直接从D-葡萄糖合成(2S)-柚皮素的合成，为经济发展过程中微生物生产黄酮类化合物提供了新的方法。

2.3 生物碱类资源微生物转化

生物碱是植物体内一类含氮有机化合物，生物碱大多有较复杂的环状结构，多呈碱性，大多具有显著的生理活性，如镇痛、解痉、抗菌消炎、止咳平喘、抗癌等作用。利用微生物转化对生物碱结构改造或者合成其他药物活性成分，有利于发现新的药用价值的生物碱衍生物。微生物转化涉及羟基化反应、氧化反应、水解反应、去甲基反应等。

原小檗碱是中药植物中丰富的生物活性分子，通过应用代谢工程与合成生物学策略可以将简单的苄基异喹啉转换至复杂的生物碱原小檗碱，通过优化酿酒酵母等载体中生物合成途径，实现原小檗碱类生物碱的高效合成[42]，这也为利用酶法合成或微生物细胞工厂从头合成其他高价值的化合物奠定基础。烟碱是在烟草中的主要生物碱，也是在烟草废弃物中主要的有毒化合物。生物修复采用高效有力的微生物特定的酶和生化途径降解烟草生物碱等剧毒杂环化合物，是清理环境污染最有前途的方法。烟碱代谢转化后，这些嗜酸性微生物使用烟碱作为唯一碳、氮和其生长的能量来源[43]。烟碱可以由细菌通过经吡啶途径或吡咯烷途径降解。6-羟基-3-琥珀吡啶(HSP)羟化酶是两通路中共同的中间关键酶，其将烟碱转化为2，5-二羟基吡啶[44]。Tang等[45]对恶臭假单胞菌降解烟碱的过程进行解析，识别参与降解过程的烟碱代谢酶，3-琥珀吡啶转化为6-羟基-3-琥珀吡啶是molybdopeterin结合氧化酶、molybdopterin脱氢酶和铁氧还蛋白共同参与的结果，此外还发现了烟碱氧化还原酶 (nicA2)，并进行基因的克隆表达。这对自然界中有毒化合物的降解有很大推动作用。由心果碱生物合成罂粟吗啡需要P450氧化还原酶的参与[46]。

2.4 其他类型化合物微生物转化

海葱提取物应用于心脏疾病的治疗已有几百年的历史。德国顺势药典中就有通过发酵步骤制备海葱提取物的制备过程，Knittel等研究发现，海葱存放一年后，由于微生物和植物酶活性下降，总的蟾蜍二烯羟酸内酯含量减少了50%，蟾蜍二烯羟酸内酯苷代谢和降解的速率也因糖苷配基结构的差异而不同。在发酵过程中，黄酮类成分也发生脱水代谢反应，这为医疗发酵海葱提取强心苷类和酚类化合物以及两者的稳定性提供了有价值的信息[47]。纳豆枯草芽孢杆菌能增加决明子活性成分蒽醌苷元的含量，从而增强决明子临床疗效[48]。Hadibarata等[49]以白腐真菌蜜环菌属F022转化蒽醌得到二氨基蒽醌、苯甲酸、2-羟基-3-萘甲酸和香豆素4种化合物，因此F022可应用于多环芳烃的生物修复。Paludo等[50]以小克银汉霉转化β-拉帕醌获得2种β-拉帕醌的糖基化衍生物，其抗乳腺癌活性虽然降低，但是细胞毒性也明显降低。

3 结语

近年来中药资源得到较大利用，其在分离纯化、药理研究以及加工技术等方面都取得了一定的进展，但是天然产物结构复杂，在自然界中含量也有限，有些化合物利用化学合成并不能完成，或者其成本较大，污染也比较严重。利用微生物转化可以有效制备化学合成难易完成的新型化合物。微生物转化成为目前药学研究者关注的热点，但是要实现工业化生产还有一定难度，微生物群基因库的探索、相关关键酶的合理设计、发酵和生物转化介质进行深入研究探索，能提高生物转化的效率。有的化合物代谢之后才能发挥药效，利用微生物对化合物进行代谢转化研究，可以避免体内代谢的损失。寻找耐酸碱、耐高压和热稳定性好的极端微生物，结合高通量筛选技术平台筛选高效新型生物催化剂，对微生物转化底物选择性及立体选择性规律、生物转化机制进行深入研究，以能定向获得目的产物或者发现高效的创新药物。中药微生物转化研究对中药资源的开发利用意义重大，通过对已有中药资源微生物转化处理，可以衍生大量的化合物，为新药物的筛选奠定基础，对药物的研发和生产具有重要的理论价值和应用前景。