结核分枝杆菌Rv1385的抗原表位预测分析

黄 劲， 王 洁， 高 霄， 雷依丽， 杨光红, 冯永红， 秦莲花*

(1.贵州医科大学 环境污染与疾病监控教育部重点实验室，贵阳 550025；2. 贵州医科大学 基础医学院， 贵阳 550025；3.同济大学 医学院附属上海市肺科医院 上海市结核病重点实验室，上海 200433；4. 贵州医科大学 公共卫生学院， 贵阳 550025)

结核病是由结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis, Mtb)引起的一种与机体细胞免疫应答密切相关的慢性消耗性传染病，宿主免疫细胞可通过其表面受体识别结核分枝杆菌抗原蛋白中特殊的化学基团，即表位 (Epitope) 而刺激机体产生免疫应答，但其机制和宿主免疫保护机制仍不清楚[1]。因此，探索结核分枝杆菌蛋白抗原表位的免疫学特性，对结核分枝杆菌致病机制的研究和表位疫苗的研发具有重要意义[2]。越来越多的研究显示，结核分枝杆菌在体内生长必需的基因及其产物可作为有效的药物研发靶点和候选疫苗[3]。

核苷酸是结核分枝杆菌生长和分化的必需物质，主要由从头合成途径产生[4]。其中，乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶(Orotidine 5’-monophosphate decarboxylase, OMPdecase; Rv1385)是嘧啶核苷酸从头合成途径最后一步反应的酶，催化乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧生成尿嘧啶核苷酸[5]。尿嘧啶核苷酸是合成其他嘧啶核苷酸的前体，对促进结核分枝杆菌的分化和增殖具有重要作用[6]。

Rv1385蛋白由结核分枝杆菌pyrF基因编码，包含274个氨基酸残基，富含丙氨酸、甘氨酸和缬氨酸等疏水性氨基酸，其相对分子质量为27.4 KD。生物信息学分析显示，Rv1385蛋白不含信号肽，亚细胞定位可能为细胞膜或细胞浆[7]。迄今，对Rv1385的抗原性研究尚无报道，本研究应用生物信息学的方法对Rv1385的抗原性进行预测分析，以期为后续深入研究结核分枝杆菌的致病机制和新的药物靶点奠定基础。

1 材料与方法

1.1 氨基酸序列

从NCBI数据库检索获得结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis, Mtb)H37Rv及15株M.tuberculosis菌株的Rv1385蛋白氨基酸序列，序列号分别为：AJF02736、WP_031708180.1、WP_031734789.1、WP_017487696.1、WP_118962198.1、 WP_031658710.1、WP_016720430.1、WP_070892765.1、WP_055366474.1、 WP_052635252.1、WP_057361138.1、WP_055375288.1、WP_116258713.1、WP_057370066.1, WP_015631297.1 和WP_019283631.1。

1.2 Rv1385的二级结构预测

应用在线软件PSIPRED Server (http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/) 预测该蛋白的二级结构。

1.3 Rv1385的B细胞抗原表位预测

应用在线软件BepiPred 1.0 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/BepiPred-1.0/) 和ABCpred(http://crdd.osdd.net/raghava/abcpred/ABC_submission.html)预测该蛋白的B细胞抗原表位。

1.4 Rv1385的CTL抗原表位预测

应用BIMAS(https://www-bimas.cit.nih.gov/molbio/hla_bind/)、SYFPEITHI(http://www.syfpeithi.de/bin/MHCServer.dll/EpitopePrediction.htm)及NetCTLpan 1.1 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetCTLpan/)预测该蛋白的CTL表位。

1.5 Rv1385的Th抗原表位预测

应用SYFPEITHI(http://www.syfpeithi.de/bin/MHCServer.dll/EpitopePrediction.htm)和NetMHCIIpan 3.2 Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHCIIpan/)预测该蛋白的Th细胞表位。

1.6 Rv1385氨基酸序列的同源性预测

应用Clustal Omega(http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo)对该蛋白的氨基酸序列进行同源性分析。

2 结果与分析

2.1 Rv1385的二级结构

PSIPRED Server结果见图1，其中α螺旋(H)、β折叠(E)、无规卷曲(C)分别占51.8%、41.6%和6.6%。

2.2 Rv1385的B细胞抗原表位

BepiPred 1.0 Server 预测结果显示95～101、109～124、152～169、178～192、198～209、218～236, 249～260等氨基酸区段可能具有抗原表位；ABCpred预测具有抗原表位可能性最大的位点依次为109～124、94～109、120～135、189～204、195～210、147～162、65～80, 168～183位点。综合两种软件预测结果的分值(≥0.65)，同时结合Rv1385蛋白的二级结构预测结果无规卷曲存在的区段进行分析，推测B细胞抗原表位较有可能位于109～124、152～169、178～192, 198～209等氨基酸区段。

2.3 Rv1385的CTL表位

应用3种生物信息学软件预测，分值较高的CTL表位结果见表1，综合分析，推测可能性较高的CTL表位存在于OMPdecase蛋白的下述氨基酸区段：263～271、87～95, 240～248。

图1 Rv1385二级结构预测结果Fig.1 Predicted secondary structure of Rv1385

表型分类BIMASSYFPEITHINetCTLpan起始位置氨基酸序列起始位置氨基酸序列起始位置氨基酸序列HLA-A2263RMRDAVAYL75263VLERTIAELRMRDAVAYL263RMRDAVAYLHLA-A3887VLVLADAKRRLAEAKARR5187AFADFAVVKDVLVLADAK//HLA-B712240KARRGPLCLLPAVAREVL200240APQAPDLSALPAVAREVL124240SPYLGFGSLLPAVAREVL

2.4 Rv1385的Th表位

SYFPEITHI 和NetCTLpan 3.2 Server在线软件预测，分值较高的Th表位结果见表2，综合2种软件结果推测Th表位可能位于77～91、87～101、234～247、70～84, 46～60。

表2 Rv1385Th表位预测结果Table 2 Predicted Th epitopes of Rv1385

2.5 Rv1385的氨基酸序列同源性分析

运用NCBI的Blast对M.tuberculosiscomplex数据库的101株菌株的Rv1385进行氨基酸序列比对，结果显示一致性为81.32%～100%。然后从中选择一致性较低的16株M.tuberculosis菌株进行同源性分析，结果见图2。

3 讨 论

结核病仍然是全球性健康性疾病，据2018年世界卫生组织的结核病报告报道，目前全世界有近1/3人口感染结核分枝杆菌，每年大约有180万人死于结核病[8]。尽管自1990年以来，结核病的发病率和新增病例有所下降，但随着多重耐药和广泛耐药结核菌株的增多，以及结核和人类免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus, HIV)共同感染患者的出现，给结核病的防治带来巨大挑战[9]。

图2 不同菌株Rv1385氨基酸序列的同源性分析Fig. 2 Multiple sequence alignment of amino acid sequences of Rv1385 from different strains

4 结 论

Rv1385含有潜在的B细胞和T细胞抗原表位，本文结果为结核特异诊断和多表位结核疫苗的研究奠定了基础。