高温胁迫对荒漠植物花花柴大分子结构的影响

朱传应 王彦芹

（塔里木大学生命科学学院/新疆生产建设兵团塔里木盆地生物资源保护利用重点实验室，新疆阿拉尔843300）

1 前言

高温胁迫对蛋白质、细胞膜、RNA种类、细胞骨架结构的稳定性和细胞内酶反应的效率等有不同程度的影响，导致细胞代谢失衡［1］。为了克服高温胁迫对细胞代谢的影响，植物和其他生物通过重新编程转录组、蛋白质组、代谢组和脂质组来应对环境温度的变化。在一定范围内的高温胁迫下，拟南芥［2］细胞中的核酸和蛋白质能发生可逆的物理变化，如DNA和RNA链的断裂溶解，蛋白质亚基降解，因此，核酸和蛋白质原则上可以作为热传感器，通过其降解程度引起下游基因的一系列表达。

花花柴（Karelinia caspica）又名胖姑娘、胖娃娃草，是菊科多年生草本植物。我国主要分布于新疆准噶尔盆地和塔里木盆地、青海柴达木盆地、甘肃西北部和北部、内蒙古西部，常大片群生，是一种改善荒漠地区生态平衡的重要植物，具有很强的防风固沙能力［3］。其叶片扁平且明显肉质化，有发达的储水组织，保水能力强；是塔克拉玛干沙漠北缘到绿洲过渡带主要的优势植物之一，在维护过渡带生态系统的结构和功能以及防风固沙方面发挥着重要的作用。阿拉尔垦区位于塔克拉玛干沙漠北部边缘地区，该地区属暖温带荒漠干旱气候，全年日照时数2 556.3～2 991.8 h，年平均气温8.9～11.4℃，夏季极端最高气温达 43.5 ℃ (http：//www.weather.com.cn/xinjiang/xjsy/tqyw/2738460.shtml)，年降水量不足100 mm，年蒸发量在1 900 mm以上［4］。为了适应这种复杂恶劣的生态环境，花花柴形成了对高温等逆境耐受性的生理特性。在非生物胁迫因子中，高温是影响植物包括生长、发育、生殖及产量等整个生育期的重要逆境因子［5］。随着全球气候变化，极端高温对植物造成的胁迫正日益加剧，人们也越来越多的关注高温对植物生长发育、大分子代谢及功能产生的影响。

彗星电泳是用来检测细胞损伤程度最经典的方法之一［6］。彗星电泳使用化学的方法使细胞膜和核膜破裂，DNA与组蛋白形成的超螺旋结构会暴露出来，再用高盐溶液提取出组蛋白后，只留下DNA超螺旋结构形成类核。此时，当DNA本身存在单链或双链断裂的损伤时，DNA超螺旋结构变得不稳定，将这种有损伤的类核置于电场中，DNA片段向阳极移动，形成一个彗星形状的图像，彗星尾部是损伤的DNA片段，DNA损伤越严重，彗星尾巴的长度与面积就会越大［7］。

目前，高温胁迫对植物的生理生化影响及耐热基因的研究已有大量报道［8-10］，但从核酸及蛋白质结构水平研究高温胁迫对植物的影响鲜有报道。本研究通过对花花柴叶片在45℃高温条件下处理0 h、2 h、4 h、8 h、12 h，提取各处理叶片DNA、RNA及蛋白质进行电泳分析，并对各处理叶片细胞的原生质体进行彗星电泳检测，为评估细胞损伤程度提供了一个简单而有效的方法，为发掘花花柴耐高温的生物学特性及资源利用提供参考依据。

2 材料与方法

2.1 实验材料

本实验所用花花柴生长于塔里木大学西区人工绿地，于5月中旬将整株花花柴连同根部土壤一起移植到花盆中，移植后在培养室中缓苗培养三天，将花花柴置于培养箱中45℃处理，分别于0 h、2 h、4 h、8 h、12 h取其叶片，一部分用于原生质体的制备；另一部分于液氮中速冻，-80℃冰箱中保存备用。同时在处理的每个时间点取其中一枝花花柴拍照以作对比。

2.2 实验方法

2.2.1 花花柴叶片总DNA、RNA、蛋白质的提取及电泳

分别取45 ℃高温处理0 h、2 h、4 h、8 h、12 h的花花柴叶片于液氮中研磨成粉末，参考黄国文等［11］的方法提取DNA，RNA提取利用TransZol Plant试剂盒,并用1%琼脂糖凝胶电泳检测，蛋白质的提取参考陆晨等［12］的方法，利用SDS-PAGE检测。使用Gel-pro Analyzer软件将得到的DNA、RNA和蛋白质电泳图条带亮度数值化，并利用Excel做成柱形图。

2.2.2 花花柴叶片原生质体的制备及彗星电泳检测

花花柴叶片原生质体的制备参考唐佳妮等［13］的方法。将高温处理不同时间的花花柴叶片去掉叶脉，将叶肉剪成0.5 cm×0.5 cm小块，放入含有酶液A（果胶酶和纤维素酶）的离心管中。将离心管放入28℃恒温水浴锅中，消化过夜。以4 000 rpm离心5分钟，出现一条绿色沉淀是为原生质体，镜检观察。利用铭博生物的彗星电泳试剂盒进行彗星电泳检测。

3 结果与分析

3.1 高温处理不同时间花花柴植株的表型变化

通过45℃高温处理后的表型发现（图1），在45℃处理2 h和4 h时花花柴萎蔫程度不明显，而在处理后8 h时花花柴叶片开始卷曲，继续处理到12 h时萎蔫程度明显加强、叶片卷曲严重。

图1 45℃高温不同处理时间花花柴表型图

3.2 45℃处理不同时间花花柴叶片DNA、RNA及蛋白质的降解程度

花花柴DNA在45℃高温处理2 h、4 h、8 h时和对照无明显差别（图2-A中的第1～4泳道），DNA基本没有降解；而在高温处理12 h时泳道出现弥散条带（图2-A中的第5泳道），表明DNA明显降解。花花柴RNA在45℃高温处理2 h、4 h时和对照无明显差别（图2-B中的第1～3泳道），处理8 h、12 h时花花柴RNA降解明显（图2-B中的第4～5泳道）。花花柴蛋白质在45℃高温处理2 h时蛋白质含量升高，处理4 h时较对照微略下降，处理8 h和12 h时蛋白质含量明显下降（图2-C中的第4～5泳道）。

图2 45℃处理不同时间点花花柴DNA、RNA及蛋白质电泳图

3.3 彗星电泳检测花花柴细胞的损伤程度

彗星电泳结果显示（图3），在45℃高温处理0 h、2 h、4 h时分别有约0%、6.3%和10%的细胞发生拖尾现象，在处理8 h、12 h时，约有22.9%和32.5%的细胞出现拖尾现象，而且在8 h、12 h时细胞形态已明显发生改变，表明8 h、12 h时花花柴叶片细胞受到了严重损伤。

图3 花花柴叶片45℃处理不同时长的彗星电泳图

4 结论与讨论

植物在生长发育过程中常常会受到各种逆境因子的危害。在诸多逆境胁迫中，高温胁迫会在短期内造成植株永久萎蔫甚至死亡。花花柴作为荒漠植物，在长期对逆境环境的适应中形成对高温、干旱、盐碱等逆境的耐受性，具有很强的自我调节和适应能力［14］。自然条件下，新疆塔克拉玛干沙漠最高气温出现在夏季的七月份，极端最高气温可达45.6℃［15］，而本试验选择的45℃对于长期生长于塔克拉玛干沙漠边缘的花花柴来说相当于极端最高气温。高温胁迫对植物核酸的损伤分为直接效应和间接效应［16］，直接效应是核酸分子吸收热能而遭受损伤，如加热会促使核苷酸中连接碱基与糖组分的β-N-糖苷键发生水解断裂［17］，间接效应是高温胁迫引起的活性氧对核酸的损害［18］。一定范围内的高温胁迫会使植物核酸及蛋白质的结构发生可逆的物理变化［19］，从而引起植物不同程度的生理反应及一系列下游基因的表达，以应对高温对植物的损害。当持续高温胁迫时，核酸及蛋白质严重损伤，无法被及时修复，只能被降解或积累而导致细胞损伤甚至死亡。本研究发现花花柴叶片在45℃高温处理4 h时DNA、RNA与对照无明显变化（图3），而蛋白质条带已有微略降解，表明蛋白质的稳定性对高温最敏感，这与梁琼麟等［20］的结论完全相符。RNA结构的完整性对高温的耐受性次之，DNA对高温的耐受时间最长，该结果与本课题组前期关于花花柴对高温耐受性的生理指标测定结果一致［14］。本研究结果显示花花柴在45℃高温处理12 h时DNA出现明显降解，处理8 h时RNA、蛋白质降解明显，且细胞拖尾现象急剧增加，形态已明显发生改变，此时细胞渗漏明显加重，而在处理4 h时DNA、RNA及蛋白质与对照无明显变化，因此花花柴在45℃恒温条件的耐受时间约为8 h属于其临界时间。晁旭等［21］发现拟南芥能忍耐的最高温度低于43℃两小时，相比较而言，荒漠植物花花柴对高温的耐受性远远高于拟南芥等模式植物。理论上，在生产应用中可通过核酸及蛋白质的降解程度来评估农作物的高温耐受性，并根据预测的气候对农作物的种植种类进行调整，以达到高产优质的效果。

近年来，随着全球气温的不断升高，植物的耐高温研究越来越引起人们的关注。无论从基础研究还是应用研究，发掘自然条件下耐高温较强的种质资源将是应对全球气候变暖、恢复天然植被的有效途径。本研究发现花花柴具有很强的高温耐受性及适应能力，可作为研究植物耐高温的重要材料和高温荒漠区生态恢复及重建的重要种质资源。同时，通过电泳检测DNA、RNA及蛋白质的降解程度，为评估细胞损伤程度提供了一个简单而有效的方法。