维甲酸诱发C57小鼠骨质疏松模型的形态学和骨密度变化

周圆媛

(川北医学院生理学教研室，四川 南充 637000)

骨质疏松是一种以骨量减少，骨微结构破坏，骨脆性增加和易发骨折的代谢性骨病〔1〕。骨质疏松性骨折及其并发症的致残率和死亡率明显增加。据流行病学调查显示，骨质疏松的发病率在各种常见病中排第7位，我国骨质疏松的总发病率在60岁以上的人群中高达58%〔2〕。随着我国人口老龄化进程，骨质疏松患病率越来越高，已成为了社会严重的公共健康问题。目前骨质疏松的病因及其发病机制尚不明确。

1 材料与方法

1.1实验动物 3月龄SPF级野生型C57小鼠100只，雌雄各半，体重23～27 g。饲养条件：温度18～20℃，通风较好，空气湿度55%～65%，专用无菌蒸馏水、无菌饲料喂养。灌胃前适应性饲养2 w，观察小鼠的一般状况，根据小鼠体重和一般状况调整灌胃药物剂量(不小于最低剂量)。动物实验人员具备动物实验从业资格，实验中对实验动物的处置符合实验动物伦理委员会要求。

1.2实验动物分组及模型建立 100只小鼠随机分为骨质疏松组和对照组各50只，雌雄各半。参照徐洪璋等〔3〕的实验方法，骨质疏松组每日0.9%维甲酸(90 ml/kg)灌胃，对照组每日0.9%氯化钠注射液(90 ml/kg)灌胃，持续21 d。

1.3骨组织标本制备 采用脊椎脱臼法将小鼠处死。测量体重后将其仰卧位固定于木板上，自两侧髋关节切开腹部皮肤，剔除肌肉、软组织，取出小鼠双侧股骨和胫骨。电子天平称量双侧股骨和胫骨湿重，取平均值(精确到0.01 g)。将取出的股骨、胫骨置入4%中性甲醛溶液中保存以备后续检查。

1.4骨组织形态学检查 Micro-CT扫描机对胫骨近端干骺端进行扫描。 在胫骨近端干骺端区域选取0.6×0.6×0.6 mm3感兴趣区域(ROI)，设定扫描机电流80 μA、电压80 kV、分辨率14 μm、扫描时间30 min，对ROI进行连续360°断层扫描，并进行三维重建，观察骨小梁的数目、结构、形态、粗细、走向等变化。

1.5统计学处理 采用SPSS22.0软件行t检验。

2 结 果

2.1一般状况 对照组牙面整齐，牙釉质牙颈部未见缺损；骨质疏松组牙面可见白色粉笔样改变，牙釉质牙颈部呈片状剥脱样缺损，没有肉眼可见的骨折。对照组体重、股骨、胫骨湿重显著高于骨质疏松组(P<0.05)。见表1。

表1 两组体重和股骨、胫骨湿重比较

与对照组比较：1)P<0.05；下表同

2.2骨组织形态学改变 胫骨近端干骺端ROI显示：对照组骨小梁的走向大致相同，粗细较均匀，排列紧密有序，有一定厚度；骨质疏松组骨小梁厚度变薄，数量变少，小梁间走向不一致，有断裂，分离度增大，形态不规则，网状结构消失，排列不均匀。见图1。

图1 胫骨近端干骺端Micro-CT扫描ROI结果

2.3骨密度和骨矿含量的改变 骨质疏松组骨矿含量(BMC)和骨密度(BMD)分别显著低于对照组(P<0.05)。见表2。

表2 BMD和BMC测量结果

3 讨 论

大部分人群在30岁以后体内骨量约以1%的速度逐年递减，女性围绝经期骨的吸收率明显增强，丢失率每年可达 5%～10%〔4〕。目前认为，在各种因素(包括遗传因素、环境因素、激素调控、物理因素、营养状况等)作用下，使原本处于动态平衡的骨吸收和骨形成作用受到破坏，从而介导了骨质疏松的发生。

本实验显示，1～3个月是小鼠生长特别迅速的时期，以骨矿物含量、骨形态的增长最为明显，而3个月以后骨骼的各项指标便趋于稳定，提示小鼠躯体已发育成熟〔5，6〕。由此可知骨质疏松的模型建立可选择骨骼发育进入稳定期的3月龄小鼠。有学者选取1～5月龄小鼠作为实验对象，研究小鼠的骨重、骨钙指标等变化，得出与上述相似的结果〔7〕。目前建立骨质疏松模型常用方法有去势建立模型和药物诱导模型。去势建立模型主要是人为摘除雄性小鼠睾丸或雌性小鼠卵巢〔8〕，模拟由性激素大幅降低引起的骨质疏松，鼠龄多选择3～6个月，时间大多在去势后4 w模型建立成功〔9〕。诱导骨质疏松的药物常见的有糖皮质激素和维甲酸。糖皮质激素可采用肌肉注射的方法，其机制是增加破骨细胞活性，促进骨吸收，造模成功需5～6 w〔10，11〕；维甲酸灌胃诱导骨质疏松是构建急性或近期骨质疏松最常用的方法〔12〕。研究显示，维甲酸可损伤性腺功能从而诱发骨质疏松〔13〕；也有学者研究显示，维甲酸可增加成骨细胞数量，增强其活性，同时刺激破骨细胞活性，由此形成骨高转换状态〔14〕。前两种方法的优点在于复制骨质疏松模型长远效果好，缺点是小鼠死亡率略高，造模周期长；维甲酸灌胃优点是小鼠死亡率极低、经济实惠、短时间内便可构建骨质疏松模型，缺点是骨质疏松长远效果不佳。据文献报道，采用高剂量(90 mg/kg)的维甲酸对小鼠连续灌胃7 d可有效构建急性骨质疏松〔3〕。

Micro-CT是一种无损伤分析骨结构很好的方法，可对小鼠是否造模成功提供重要依据。通过Mirco-CT对小鼠骨组织进行三维重建，不仅可以观察到骨组织的微结构特征，还能通过骨小梁相关参数更直观地反映骨组织的状态〔15〕。本实验通过Micro-CT可观察到骨质疏松组小鼠符合骨质疏松影像学表象，由此可知维甲酸诱导3月龄的SPF级野生型C57小鼠建立骨质疏松动物实验模型可靠。