萍乡地区高危型人乳头瘤病毒分型检测及感染情况分析

任 妹 何 雯 蔡丽娟 黄永建

(萍乡市人民医院检验科，萍乡337000)

宫颈癌作为妇女中常见的恶性肿瘤，其发病率在世界范围内排名第二，仅次于乳腺癌，近年来的发病率不降反增，更加趋于年轻化[1]。宫颈癌的发生是由多种因素共同影响导致的结果，而大量研究表明，其主要因素是宫颈人乳头瘤病毒(Human Papillomavirus,HPV)的持续性感染[2]。HPV的筛查是预防宫颈癌的一项重要措施，也是诊断宫颈早期病变的重要手段。目前对于HPV的感染还没有明确有效的治疗方法，主要依赖于HPV疫苗预防接种。多项研究表明[3]，HPV感染具有较大的地区差异性，不同国家之间、不同地区之间在HPV感染类型、多重感染情况等多方面都存在着不同程度的差异。本研究通过收集萍乡市人民医院2017年1月～12月HPV分型检测的结果，统计分析HPV感染阳性率和亚型分布情况，以及HPV感染与年龄、就诊途经的相关性，为临床诊断、治疗及预防提供科学依据。

1 资料与方法

1.1 资料

1.1.1 研究对象 收集2017年1月～12月在萍乡市人民医院门诊、体检和住院行HPV分型检测的3 797例女性患者宫颈拭子，年龄范围17～82岁，平均年龄(42.9±11.4)岁，按不同年龄段分为5个组，其中<30岁者366例，30～39岁者1 055例，40～49岁者1 510例，50～59岁者619例，≥60岁者247例。

1.1.2 试剂与器材 PCR扩增仪(上海之江生物)、高速低温离心机(美国贝克曼公司)、八联管微量离心机(珠海黑马)、干式恒温器(杭州奥盛)、漩涡振荡器(海门其林贝尔)、生物安全柜(北京阿尔泰)。

1.2 方法

1.2.1 HPV核酸分型测定 实验使用上海之江生物科技有限公司生产的人乳头瘤病毒高危型分型核酸测定试剂盒，采用15种高危型HPV型别(16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68、82)的特异性引物及荧光探针，应用聚合酶链反应(PCR)结合Taqman技术，对15种HPV亚型的特异性DNA核酸片段进行分型定性检测。

1.2.2 荧光定量PCR扩增 将配制好的试剂以每份36 μl分装于薄壁PCR反应管中，然后将标本和阴阳对照处理后所得反应模板各4 μl分别加入薄壁PCR反应管，反应体系共40 μl。加样完成后立即将反应管置于荧光PCR仪上进行扩增反应，扩增程序为:94℃ 2 min，再按93℃ 10 s→ 62℃ 31 s循环40次；单点荧光检测在62℃进行。

1.3 统计学方法 采用Excel 2010进行数据整理，采用SPSS21.0统计软件进行数据统计分析，组间比较采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HPV总体感染和亚型分布情况 本研究对3 797例宫颈脱落细胞样本的基因分型结果的统计显示，HPV阳性标本786例，阴性标本3 011例，总阳性率为20.70%(786/3 797)。786份阳性样本中，15种HPV亚型累计标本频次为992次，15种基因型均有检出，其中HPV52亚型阳性率达6.82%，占所有亚型阳性率的构成比为26.11%；其次为HPV58、HPV16、HPV39、HPV18和HPV51，占比分别为15.12%、14.52%、8.47%、6.75%、6.75%。HPV45型感染例数最低为13例，阳性率0.34%，占1.31%。各亚型检出率详见图1。

2.2 不同年龄段HPV的感染情况 将研究对象按年龄从小到大排序进行分组统计，50～59岁年龄段阳性率最高，为26.98%，其次为≥60岁和<30岁年龄段，经多组间χ2检验显示，各年龄组间的HPV感染情况差异有统计学意义(χ2=23.894，P<0.05)。HPV52、58、16型在各年龄阶段感染率均占据前三位，在具体型别中，只有HPV16、18、56和58四种亚型的感染在不同年龄段间差异具有统计学意义(P<0.05)，其他亚型在各年龄段中无统计学意义(P>0.05)。结果详见表 2、3。

2.3 HPV单一型和多重感染情况 786例阳性标本中，单一亚型感染患者有628例，占全部阳性患者的79.9%(628/786)，其中以HPV52、HPV58、HPV16占绝大多数；多重感染患者共158例，占全部阳性患者的20.1%(158/786)；多重感染中二重感染为主，占全部多重感染的79.11%(125/158)。 单一感染、双重感染和三重感染都为40～49岁组分布最多。单一感染所占比最高在30～39岁年龄段(83.92%)，多重感染占比最高在<30岁年龄段，多重感染占比最低在30～39岁年龄段(16.08%)，而随着年龄的增长，多重感染占比呈现上升趋势。在多重感染中，绝大多数为HPV52型合并的多重感染，有78例，占全部多重感染的49.79%，与各亚型阳性率结果大致一致。详见表4、图2、3。

图1 高危型HPV亚型阳性率(%)Fig.1 Positive rate of high-risk HPV subtypes(%)

表2 不同年龄段高危型HPV感染情况

Tab.2 High-risk HPV infection in different age groups

Age(year)NumberPositive casePositive rate(%)<303667921.5830-391 05519918.8640-491 51028018.5450-5961916726.98≥602476124.70Total3 79778620.70

表3 各年龄组15种高危HPV亚型感染情况

Tab.3 Infection status of 15 high-risk HPV subtypes in each age groups

HPV subtypeAge(year)<30(n=366)30-39(n=1 055)40-49(n=1 510)50-59(n=619)≥60(n=247)χ2PHPV5222709356186.3860.172hPV58153250391414.9160.005HPV16133346312121.161<0.001HPV391026301261.3910.846HPV189131818915.4090.004HPV51721211533.5550.471HPV3345141238.6780.070HPV5961013712.8740.579HPV666511635.3950.249HPV568676212.4420.014HPV312410345.3680.252HPV681511025.3950.203HPV823110206.7750.103HPV35167101.9160.749HPV45251416.0600.195Total791992801676123.89<0.001

Note：There are multiple infections,and the samples of each subtype of infection are not counted repeatedly.

表4 不同年龄组高危HPV亚型单一感染及多重感染情况

Tab.4 Single and multiple infections of high-risk HPV subtypes in different age groups

Age(year)Infection typeSingle infectionThe dual infectionTriple infectionFour heavy infectionFive heavy infectionMore than five heavy<305619211030-3916727401040-4922645720050-59132275120≥604774300Total628(79.0%)125(15.9%)22(2.8%)7(0.89%)4(0.51%)0(0.0%)

图3 不同年龄组高危HPV亚型单一感染和多重感染构成比Fig.3 Ratio of single and multiple infections of high-risk HPV subtypes in different age groups

表5 不同就诊途径患者高危HPV感染情况

Tab.5 High-risk HPV infection in patients with different treatment approaches

ClinictypenPositivecaseNegativecasePositive rate(%)Outpatient3 4047072 67920.77Hospitalization3466729719.36Physical exam47123525.53Total3 7977863 01120.70

2.4 不同就诊途径女性HPV的感染情况 门诊患者共3 404例，阳性707例(20.77%)；住院患者共346例，阳性患者67例(19.36%)；体检患者共47例，阳性患者12例(25.53%)。体检组的阳性率最高，住院组的阳性率最低，经多组间χ2检验显示，不同就诊途径间的HPV感染情况差异无统计学意义(χ2=1.902，P>0.05)。各组感染情况详见表5。

3 讨论

3.1 HPV与宫颈癌 HPV感染与宫颈上皮内瘤样病变(Cervical intraepithelial neoplasia，CIN)、宫颈癌(Cervical cancer，CC)、食管癌、肛管癌等多种病症有着密切的联系，其中与宫颈癌的关系最为密切[4]。目前已知的有200多种亚型，根据其致病性的强弱，可分为高危型(HR-HPV)和低危型(LR-HPV)，高危型包括16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58和59等型，与食管癌、乳腺癌等多种恶性肿瘤的发生密切相关，是高度宫颈上皮内病变(CINⅡ、CINⅢ)的致病因素；低危型包括6、11、42、43等型，主要与外生殖器尖锐湿疣、扁平疣和低级别的子宫颈上皮内病变(CINⅠ)相关，不发生恶性病变[5]。关于HPV感染与宫颈疾病进展的相关性的研究显示，高危型HPV的感染率越高，宫颈病变程度越严重[6]；因此，HPV的筛查对于宫颈癌的防治起到了十分重要的作用，特别是高危型HPV的检测，是筛查宫颈病变以及判断宫颈病变程度的重要手段。

3.2 HPV的感染率与亚型分布情况 HPV的感染具有很强的地域差异，其发病率在全世界各个地域都有所不同，美国女性HPV感染率为39.9%，其中高危型感染率20.4%[7]；孟加拉国的HPV感染率为21.1%[8]。而在同一地域随着时间的迁移感染率也随之发生不同程度的变化，Wu等[9]在2013年报道中国女性的HPV感染率为14.3%，Wu等[10]在2017年报道为22.7%。本研究阳性检出率为20.7%，结果低于Wu等[10]报道的中国女性HPV感染率(22.7%)，与杭州地区近几年综合感染率(20.54%)接近[11]。关于HPV的流行病学调查研究表明，HPV的亚型分布在不同地域存在明显的差异[12]。HPV16是在世界范围内最常见的亚型[13]，其次为HPV18型。研究统计显示，北美洲HPV感染前五位为HPV16、53、52、18和39，欧洲为HPV16、18、31、33和58，亚洲为HPV16、52、58、18和56[14]。中国总体易感的HPV亚型主要为HPV16、18、58、33、52等型，其中HPV16为最主要亚型，18和58型分居二、三位[15]。上海地区HPV感染居前五位的是HPV16、52、58、53和33[16]；深圳福田区高危型HPV中感染前五名分别为HPV52、16、58、39和51型[17]，其中52型感染率显著高于其他亚型，16与58型之间差距较小位于二、三位。本研究15种高危型HPV亚型全部检出，结果显示主要感染的HPV型别依次为HPV52型(6.82%)，HPV58型(3.95%)、HPV16型(3.79%)、HPV39型(8.47%)、HPV18型和HPV51型(6.75%)，结果与深圳福田区的感染情况相似[17]，与早期Bao等[18]报道的中国女性首选HPV型为HPV52和58 型这一结论相一致。在本研究中，HPV16不是最主要感染型别，这与其他地区的分布情况有所区别，其中的原因可能是地域或种族的差异，与城市的经济水平相关。

3.3 HPV多重感染情况 HPV的多重感染是指个体感染两种或两种以上亚型的HPV的情况，本研究中感染总体以单一感染为主，占全部HPV阳性者的79.9%(628/786)，各年龄段中也为单一感染占绝大部分比例，这与相关研究报道的HPV感染的主要形式为单一感染的结论相一致[19]。在多重感染中，出现最多次数的是HPV52型，其次依次是HPV58合并的多重感染。成帆等[20]针对HPV多重感染进行了专门的多组别分析，结果发现HPV16和18两种亚型具有较高和其他亚型合并感染的机会，且多重感染中高危型HPV更加常见；另有文献报道HPV31、33、35和52型与HPV16有一定的相关性[21]，HPV39、45、59和68型与HPV18更有关联，不同研究显示不同的分析结果，但形成这些结果的原因究竟是HPV自身的生物学因素，还是宿主的生物学因素，还有待专家学者们研究。

3.4 HPV感染与年龄的关系 年龄是感染HPV的一个重要的因素，文献表明，HPV的感染存在两个年龄段高峰，<30岁的年轻女性HPV感染率较高[14，22]，最主要的原因是该年龄段性行为频繁，且缺乏与性行为相关的卫生知识，其次为该年龄段女性的免疫系统对HPV不敏感，容易造成HPV的感染，但更多的是一过性的感染[23]。随着年龄的增高，感染率随之下降，但随着时间的积累，由于生育、流产和性行为等造成的机械性刺激或损伤，以及绝经后女性体内雌激素分泌降低，免疫功能降低等原因，导致HPV的反复和持续感染增加，于是形成第二个感染高峰。研究显示不同地区的年龄分布情况存在差异，杭州地区HPV感染的年龄分布为15～24岁和>54岁两个高峰，其中15～24岁感染率最高[14]；河北地区HPV阳性率为≤30岁年龄段最高，其次为>50岁年龄段，30～40岁年龄段最低[24]。本研究感染高峰年龄在50～59岁之间，其次为≥60岁和<30岁，整体呈两端较高而中间较低的U型分布，也可以说50岁以上和30岁以下两个年龄段女性是HPV感染高危人群。本研究与杭州、河北地区感染情况相似。对于50岁以上的女性人群，由于病毒的持续和反复感染，更应该加大筛查力度，做到早发现、早治疗。此外，该研究中有8例20岁以下女性，HPV阳性者3例，此年龄段女性在心理上较不成熟，自身的防护意识较弱以及缺乏生理卫生知识[25]，这是一个值得关注的问题，因此，社会对青少年的生理健康教育工作应该加以重视。

3.5 不同就诊途径HPV感染情况 目前关于不同就诊途径的分析在全国范围内研究报道较少，王京伟等[26]对湖北地区的研究显示，低危型HPV组中体检组明显高于其他两组，高危型HPV组中门诊组和住院组明显高于体检组，差异均有统计学意义(P<0.01)。本研究中对象包括3 404例门诊患者、346例住院患者和47例体检患者，阳性检出率分别为20.77%、19.36%和25.53%，经χ2检验发现组间差异无统计学意义(χ2=1.902，P>0.05)，结果与王京伟的结果不相符，分析本研究中门诊、住院和体检患者的人数相差悬殊，是由于患者检查通常都是先在门诊挂号检查，且只有一部分有严重宫颈病症的患者才会住院治疗，另一方面，体检人员没有主动进行HPV分型检测的意识，其中可能也存在HPV与宫颈病变相关宣传教育工作的力度还需加强的原因，使得该项目体检人数较少，究竟不同就诊途径的HPV感染情况是否具有统计学意义，还需要更多的研究。

本研究结果显示萍乡地区高危型HPV感染阳性率为20.7%，以单一感染为主，感染型别主要为HPV52、HPV58、HPV16、HPV39、HPV18和HPV51型，HPV16不是最主要亚型，HPV52和58比HPV16在该地区更加常见，提示应加强对HPV52和58型的重视，提倡包含HPV52和58型的HPV疫苗的生产和在该地区的应用，使该地区HPV得到有效控制；本研究结果显示各年龄段中HPV感染情况不同，50～59岁感染率最高，其次为≥60岁和<30岁，各年龄组间差异有统计学意义，说明50岁以上和30岁以下女性是该地区HPV的易感人群，在宫颈癌的筛查和预防时应更加关注这两个年龄段，建议加大关于HPV感染与宫颈癌的宣传教育，鼓励女性尽早并定期进行HPV筛查检测，以便更早更快的发现和治疗宫颈疾病，防止宫颈癌的发生。