女贞子标准煎液综合性评价

王相 范帅帅 冯玉 杨梦婷 李军山 牛丽颖

摘要：目的  制备女贞子饮片标准煎液，并进行质量标准研究。方法  制备16批不同产地女贞子饮片标准煎液，以特女贞苷为定量检测指标，计算转移率与出膏率，并建立其UPLC特征图谱，采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版）》软件进行分析。结果  16批女贞子标准煎液特女贞苷转移率为33.57%～56.91%，出膏率为23.20%～26.87%。UPLC特征图谱标定了10个共有峰，指认了其中1个峰。16批女贞子饮片标准煎液相似度评价结果显示其相似度均大于0.90。聚类分析将16批女贞子标准煎液分为2类;主成分分析提取出了3个主成分，其累积贡献率达92.73%。结论  本研究可为女贞子标准煎液及其配方颗粒的质量控制提供参考。

关键词：女贞子;标准煎液;转移率;特征图谱;主成分分析

中图分类号：R284.1    文献标识码：A    文章编号：1005-5304（2019）07-0084-05

Abstract： Objective To prepare Ligustri Lucidi Fructus standard decoction; To study the quality standard. Methods Sixteen batches of Ligustri Lucidi Fructus standard decoction were prepared. With specnuezhenide as the detection index， the transfer rate and extractum rate were calculated and the UPLC characteristic chromatograms analysis method was established. Similarity Evaluation System for Chromatographic Fingerprint of TCM （2012 edition） was used to analyze and compare the characteristic chromatograms. Results The transfer rates of 16 batches of Ligustri Lucidi Fructus standard decoction ranged from 33.57% to 56.91%， and extractum rates were at the range of 23.20%–26.87%. Ten common peaks were determined and one was identified. The similarity evaluations were carried out on 16 batches of Ligustri Lucidi Fructus standard decoction， and their similarities were all greater than 0.90. 16 batches of Ligustri Lucidi Fructus standard decoction were divided into 2 categories according to hierarchical cluster analysis. 3 principal components were extracted by PCA， whose cumulative contribution rate was 92.73%. Conclusion The study and preparation of Ligustri Lucidi Fructus standard decoction can provide a reference for the quality control of Ligustri Lucidi Fructus formula granules.

Keywords： Ligustri Lucidi Fructus; standard decoction; transfer rate; characteristic chromatogram; PCA

女貞子为木犀科植物女贞Ligustrum lucidum Ail.的干燥成熟果实。冬季果实成熟时采收，除去枝叶，稍蒸或置沸水中略烫后干燥，或直接干燥。女贞子味甘、苦，性凉，归肝、肾经，具有滋补肝肾、明目乌发功效，用于肝肾阴虚、眩晕耳鸣、腰膝酸软、须发早白、目黯不明、内热消渴、骨蒸潮热[1]。女贞子主要含有环烯醚萜苷类、三萜类、苯乙醇类、黄酮类、多糖类等成分，环烯醚萜苷类、苯乙醇类化合物是其重要的活性成分[2]，包括特女贞苷、橄榄苦苷、女贞苷、松果菊苷、毛蕊花糖苷、红景天苷、酪醇等。现代药理研究表明，女贞子具有免疫调节、强心、抗动脉粥样硬化、降血脂、降血糖、保肝、抗氧化、抗衰老、抗疲劳、抗炎抗菌、抗肿瘤、调节激素、促毛囊生长等作用[3]。

中药配方颗粒作为一种新型中药饮片形式，具有积极的临床意义和实用价值，是中药发展的机遇和挑战，但目前仍存在标准不统一、制备工艺不完善等问题。为解决中药配方颗粒发展所面临的多种问题，国家药典委员会2016年发布了《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求（征求意见稿）》，该技术要求明确提出将标准汤剂作为中药配方颗粒是否与临床汤剂基本一致的标准参照物。中药饮片标准汤剂是指以中医药理论为指导，选取道地药材或主产区药材，经加工炮制成合格饮片后，参考现代提取方法，经标准化工艺制备而成的单味中药饮片水煎剂[4]。中药饮片标准汤剂的制备遵循传统汤剂的煎煮原则，整个流程具有标准化和规范化的特点，能够保证工艺的统一，进而保障其质量的稳定和统一，提高临床用药的准确性和剂量的一致性。本研究选用主产区符合规范的16批女贞子饮片制备标准煎液，以特女贞苷为指标成分，测定其含量，计算转移率和出膏率范围，并进行特征图谱研究，为女贞子饮片标准煎液质量标准的制定提供基础研究数据，同时提高女贞子配方颗粒的质量控制水平。

1  仪器与试药

ACQUITY UPLC H-Class系统（PDA检测器），美国沃特世公司;Empower3色谱工作站，美国沃特世公司;LC-15C高效液相色谱仪，日本岛津公司;Pilot5-8L真空冷冻干燥机，北京博医康实验仪器有限公司;BSA224S-CW电子分析天平，北京赛多利斯;JY10001型电子天平，上海民桥精密科学仪器有限公司;KQ-250型超声波清洗器（功率250 W，频率40 kHz），昆山市超声仪器有限公司;RE-3000型旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器厂;BJH-W200F型陶瓷自动中药煲（电源220 V、50 Hz，功率300 W，容量3.0 L），广东天际电器股份有限公司。

特女贞苷对照品（批号111926-201605，纯度93.3%），中国食品药品检定研究院;甲醇、乙腈，Fisher化学试剂公司;磷酸为色谱纯，水为超纯水，其他试剂均为分析纯。16批不同来源女贞子饮片均由神威药业集团有限公司提供，样品信息见表1。

2  方法与结果

2.1  标准煎液的制备

取女贞子饮片100 g，煎煮2次。一煎加8倍量水，浸泡30 min，武火煮沸，文火保持微沸60 min;二煎加6倍量水，武火煮沸，文火保持微沸40 min。趁热用120目筛网过滤，合并2次煎液，迅速冷却。55 ℃真空减压浓缩至密度为1.01～1.06时，冷冻干燥，得干膏粉，即标准煎液干燥粉末，计算出膏率，测定水分[5]，结果出膏率为23.20%～26.87%，见表2。

2.2  特女贞苷含量测定

2.2.1  色谱条件

色谱柱：Wondasil C18（4.6 mm×250 mm，5 ?m）;以乙腈为流动相A，0.1%磷酸为流动相B，甲醇为流动相C，按表3进行梯度洗脱;流速：1.0 mL/min;检测波长：224 nm;进样量：10 ?L。女贞子标准煎液色谱图见图1。

2.2.2  对照品溶液的制备

精密称取特女贞苷对照品适量，加稀乙醇制成每l mL含0.102 4 mg特女贞苷的溶液，即得。

2.2.3  供试品溶液的制备

取干膏粉适量，研细，取约0.1 g，精密称定，置50 mL容量瓶中，精密加入稀乙醇50 mL，称定质量，超声处理（功率250 W，频率40 kHz）10 min，放冷，用稀乙醇溶液补足减失的质量，摇匀，过滤，即得。

2.2.4  方法学考察

2.2.4.1  线性关系考察

精密吸取对照品溶液2、4、8、12、16、20 ?L，按上述色谱条件测定。以特女贞苷进样量为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，结果特女贞苷在0.219 5～2.195 1 ?g范围内线性关系良好，回归方程为Y=1.051 1×106X-4.233 9×104，r=0.999 7。

2.2.4.2  精密度试验

精密吸取对照品溶液10 ?L，按上述色谱条件连续进样6次，计算得特女贞苷含量RSD=1.86%，表明仪器精密度良好。

2.2.4.3  稳定性试验

精密称取干膏粉约0.1 g，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，精密吸取供试品溶液10 ?L，按上述色谱条件分别于0、2、4、8、12、18、24 h进样测定，计算得特女贞苷含量RSD=0.86%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.2.4.4  重复性试验

精密称取干膏粉6份，每份约0.1 g，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，精密吸取供试品溶液10 ?L，按上述色谱条件进样，计算得特女贞苷含量RSD=0.42%，表明本法重复性良好。

2.2.4.5  加样回收率试验

取同一批干膏粉6份，每份约0.05 g，精密稱定。设高、中、低浓度组，分别按1∶0.8、1∶1、1∶1.2精密加入一定体积的特女贞苷对照品溶液，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，按上述色谱条件测定，计算平均回收率为102.7%。

2.2.5  样品测定

采用上述色谱条件测定16批女贞子饮片和标准煎液中特女贞苷的含量和转移率，结果特女贞苷转移率为33.57%～56.91%，见表4。

2.3  特征图谱的建立与评价

2.3.1  色谱条件

色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 ?m）;流动相：0.1%磷酸（A）-乙腈（B），梯度洗脱（0～3 min，97%～95%A;3～5 min，95%～92%A;5～7 min，92%～90%A;7～9 min，90%～88%A;9～11 min，88%～86%A;11～13 min，86%～84%A;13～15 min，84%～82%A;15～17 min，82%～80%A;17～19 min，80%～78 %A;19～21 min，78%～75%A;21～23 min，75%～70%A;23～26 min，70%A）;流速：0.3 mL/min;检测波长：224 nm;柱温：35 ℃;进样量：1 ?L。在此色谱条件下，各色谱峰与相邻峰的分离度良好，峰形对称。UPLC特征图谱见图2、图3。

2.3.2  对照品溶液的制备

精密称取特女贞苷对照品适量，置50 mL容量瓶中，加稀乙醇溶解并稀释至刻度，配制成每1 mL含0.075 mg特女贞苷的对照品溶液。

2.3.3  供试品溶液的制备

取干膏粉适量，研细，取约0.1 g，精密称定，置100 mL锥形瓶中，精密加入稀乙醇50 mL，称定质量，超声处理（功率250 W，频率40 kHz）10 min，放冷，用稀乙醇溶液补足减失的质量，摇匀，过滤，即得。

2.3.4  方法学考察

通过与对照品色谱图比对，指认8号峰为特女贞苷，选择该峰为参照峰，计算女贞子饮片、标准煎液中主要特征峰的相对保留时间、相对峰面积。

2.3.4.1  精密度试验

精密吸取同一份供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件连续进样6次，计算得各共有峰的相对保留时间和相对峰面积RSD均小于3%，符合特征图谱要求，表明仪器精密度良好。

2.3.4.2  稳定性试验

精密吸取同一份供试品溶液，分别于制备后0、2、4、8、12、16、24 h进样分析，记录各峰的峰面积。计算得各共有峰的相对保留时间和相对峰面积RSD均小于3%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.3.4.3  重复性试验

称取同一批样品各约0.1 g，按“2.3.3”项下方法平行制备6份供试品溶液，按“2.3.1”项下色谱条件进样分析并记录峰面积，计算共有峰的相对保留时间和相对峰面积RSD均小于3%，表明本法重复性良好。

2.3.5  特征图谱的建立

分别制备16批女贞子标准煎液供试品溶液，按“2.3.1”项下色谱条件进样测定，采用国家药典委员会《中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版）》对色谱图进行匹配，得到特征图谱。女贞子标准煎液确定了10个共有峰，根据色谱峰匹配结果进行相似度分析，16批标准煎液与对照图谱的相似度均大于0.9，符合指纹图谱相似度要求。

2.4  主成分分析

依据16批女贞子标准煎液特征图谱，选择10个共有峰作为分析变量，将数据导入SPSS22.0统计软件进行主成分分析。结果3个主成分的累积方差贡献率达到92.734%，代表了10个分析变量的大部分信息。其中第1主成分的贡献率最大（57.701%），其次为第2主成分（29.193%）。第1主成分中变量值权重大者分别为峰4、5、8、9、10号峰，与特征图谱峰面积占比相当。可将16批样品分为2类，Ⅰ类包括河南、山西、四川、浙江、湖北产区样品，Ⅱ类包括安徽产区样品。结果见表5、图4。

2.5  聚类分析

对16批女贞子标准煎液共有峰峰面积采用组间平均数联结法进行聚类分析，结果见图5。可见，当欧式距离为15时，16批女贞子样品可聚为2类，Ⅰ类包括河南、山西、四川、浙江产区样品，Ⅱ类包括湖北、安徽产区样品。与主成分分析结果基本一致，同时也说明女贞子产地不同对其质量稍有影响。

3  讨论

女贞子标准煎液的工艺研究中，发现饮片粉碎粒度对出膏率的影响较大，而对特女贞苷含量影响较小，因此在制备过程中，选择机械碾压破壁即可，无需粉碎，可为后续生产提供方便。

女贞子含量测定多以脂溶性成分为主[6-7]，而女贞子标准煎液为纯水提取，该类成分在标准煎液中未检出或含量太低而不能定量或指认，因此选择指认特女贞苷峰。本试验发现有一含量较高且峰形完整、分离度较好的峰，但未能指认，有待进一步研究。試验过程中发现，采用2015年版《中华人民共和国药典》（一部）女贞子项下含量测定方法，特女贞苷峰有拖尾，进行调整后未能分开，经摸索，以甲醇-乙腈-磷酸水溶液三相为流动相进行洗脱，特女贞苷峰分离度高且无拖尾，重现性、稳定性均良好，故采用三相洗脱用于女贞子标准煎液含量测定。

参考文献：

[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[M].中国医药科技出版社，2015：45-46.

[2] 姜秋，蒋海强，李慧芬，等.女贞子酒蒸过程中5种苯乙醇类成分的变化规律[J].中国实验方剂学杂志，2014，20（16）：60-63.

[3] 李建芬.中药女贞子研究进展[J].内蒙古中医药，2012，31（16）：45- 46.

[4] 陈士林，刘安，李琦，等.中药饮片标准汤剂研究策略[J].中国中药杂志，2016，41（8）：1367-1375.

[5] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：三部[M].北京：中国医药科技出版社，2015：461.

[6] 任爽，李铮，王京辉，等.中药女贞子饮片中8个成分的含量比较研究[J].药物分析杂志，2015，35（8）：1393-1402.

[7] 梁晓，吴鹏，张学兰，等.女贞子不同炮制品HPLC指纹图谱色谱峰的归属与比较[J].中药材，2015，38（11）：2288-2292.