不同浓度弗氏佐剂对B6AF1 小鼠免疫性卵巢早衰模型建立的影响

陈 玥, 王佩娟, 陈 思, 卢 燕

(南京中医药大学附属中西医结合医院妇产科, 南京 210028)

卵巢早衰(premature ovarian failure, POF)是指40岁之前由于卵巢内卵泡耗竭或破坏而发生卵巢功能衰竭的一种综合征。POF 的发病率： 20 岁以前约为0.01%, 30 岁前约0.1%, 40 岁前约1%[1]，超过半数的本病患者具有不良情绪甚至抑郁、厌世[2]，严重影响女性身心健康，造成社会负担。发病率的逐年升高及病患年轻化的现状，与生育年龄的整体延后和社会对精神心理健康关注形成强烈矛盾。本病的致病因素包括：遗传因素、感染因素、自身免疫因素、医源性损伤及精神因素等[3]，约1/3 的POF 的发病与自身免疫异常密切相关。然而迄今为止，有关POF 的免疫学机制研究进展十分缓慢，究其原因之一是缺乏用于开展各项药物实验的标准化动物模型。本研究根据近几年国内外POF相关动物模型研究进展，选取(C57BL/6 × A/J) F1(B6AF1)雌鼠作为研究对象，将透明带3 多肽(pZP3) 抗原分别与不同佐剂混合免疫小鼠, 观察其免疫效果, 以期建立免疫性POF动物模型，进一步探究POF 的免疫调节机制。

1 材料与方法

1.1 动物

SPF 级雄性 A/J 小鼠10 只，雌性C57BL/6小鼠30 只，均为7～9 周龄，购自中国人民解放军军事医学研究院实验动物中心[SCXK-(军)2007-004]，于江苏省中医药研究院屏障设施饲养并繁殖B6AF1 小鼠[(C57BL/6×A/J) F1]。本实验取6～8 周龄B6AF1 雌鼠80 只分为：空白组、不完全弗氏佐剂(IFA)组、完全弗氏佐剂(CFA)[含结核分枝杆菌(TB)1 mg/mL] 组和IFA+ TB(3.3 mg/mL)组，每组20 只。体质量21～23 g，自由摄食饮水，每日保持12 h 明暗交替，温度20～25 ℃，相对湿度40%～50%[SYXK(苏)2016-0018]。

1.2 实验试剂

透明带3(ZP3)330～342 氨基酸系列的多肽片断[pZP3，ZP3330-342(NSSSSQFQIHGPR)]，分析纯度＞95%，购自上海吉尔生化有限公司。IFA(#344291)、CFA(#344289)购自美国Sigma 公司，结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis H37 Ra, #231141) 购自美国BD Difco 公司。

1.3 实验处理与分组

采用双蒸水将pZP3 配制成为1 mmol/mL的溶液。与1.1 对应的3 组分别选取 IFA、含1 mg/mL的TB H37Ra 的CFA、 经配制含有3.3 mg/mL 的TB H37Ra 的CFA与pZP3 溶液按等比例混合配成免疫乳化剂，用0.1 mL 乳化剂注射脚掌和尾根皮下免疫小鼠，第14 日加强免疫1 次。空白组选择生理盐水。

1.4 取材与卵巢HE 染色

自第1 次免疫后28 d 处死小鼠，取小鼠卵巢组织HE 染色： 将卵巢放入Bouin 氏固定液，24 h后脱水包埋，常规石蜡切片5 μm，进行HE 染色。病理切片在倒置显微镜下进行拍照观察。

1.5 统计学方法

采用SPSS 20.0 软件进行统计学分析，组间比较采用χ2检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况

免疫各组B6AF1小鼠均出现了体质量明显下降，精神萎靡不振、反应迟钝和行动迟缓。

2.2 小鼠动情周期的改变

免疫后各组小鼠出现不同程度的动情周期紊乱, 表现为动情周期缩短、延长和持续动情周期，与空白组相比差异有统计学意义(P＜0.05)(表1)。

2.3 卵巢组织病理学观察

空白组卵泡数量较多，发育较好，有成熟卵泡，各级卵泡均有，卵泡形态规则，颗粒细胞排列整齐(图1A)； IFA 组见少量卵泡，卵泡形态尚规则，颗粒细胞排列较紊乱，有一个次级卵泡(图1B)； CFA 组见大量初级卵泡，卵泡形态尚规则，颗粒细胞排列紊乱(图1C)； IFA+TB 组见少量卵泡，未见次级卵泡及成熟卵泡，卵泡形态不规则，颗粒细胞排列紊乱，可见淋巴细胞及浆细胞浸润(图1D)。说明不同浓度佐剂免疫后均导致小鼠POF 模型，高浓度组免疫效果最好。

3 讨论

Rhim 等[4]在1992 年报道pZP3 可诱导小鼠产生抗ZP3 抗体, 与卵巢ZP3 结合引起免疫反应, 从而引起类似于人类POF 的表现如储备卵泡减少、卵巢体积萎缩等。不同种系小鼠在免疫反应性方面存在显著差异, 相同剂量pZP3 可引起B6AF1、BALB/c 小鼠自身免疫性卵巢炎，之后陆续有学者[5-7]选用BALB/c 小鼠造模成功。本研究选用成模率较高的B6AF1 雌鼠作为研究对象[8], 用弗氏佐剂联合pZP3 多肽造模，具有操作简单、成模率高和死亡率低等优点。结果提示, 与空白组比较,模型组小鼠的动情周期紊乱，卵巢萎缩，卵巢组织病理表现提示为自身免疫性卵巢炎, 且卵巢组织内淋巴细胞大量浸润, 符合免疫性POF 的特点[9]。

佐剂本身不具备免疫原性, 与抗原物质一起注射或预先注入机体后，起到免疫增强的作用，使机体更早、更有效、更持久地产生免疫应答[10]，佐剂与抗原合用时能显著增强抗原免疫效应[11]。其可能的作用机制有二：一是与局部淋巴细胞接触可浓缩抗原, 即储存效应(depot effect)； 二是通过诱导细胞因子的产生，调节淋巴细胞的功能。

表 1 不同组别小鼠动情周期的改变Table 1 Change of estrous cycle in the four groups

A： 空白组； B： IFA 组； C： CFA 组； D： IFA+TB 组图 1 小鼠模型卵巢病理图(HE ×100)

佐剂与抗原混合后形成“油包水”乳胶混合体, 这种抗原佐剂混合物的优点在于： 一方面，抗原被乳剂包裹后可在注射部位缓慢释放，能够非常有效地诱导产生高滴度的抗体；另一方面，油滴中免疫原的持续释放加强佐剂活性，刺激局部免疫反应。目前动物实验中常用的有弗氏佐剂、卡介苗、脂质体和类病毒颗粒等。弗氏佐剂分为CFA 和 IFA 两种，区别是前者含有TB 成分。CFA 所含的TB 的细胞壁成分可以加强机体对抗原的抗体反应。虽然有报道[12]其可引起注射局部皮肤溃疡等反应。且有致敏以及潜在的致癌作用等毒副作用，但其高度佐剂活性是其它物质难以媲美的。

综上所述，弗氏佐剂联合pZP3 诱导B6AF1小鼠可以成功构建免疫性POF模型，同时引起卵巢组织局部淋巴细胞大量浸润导致免疫性卵巢炎，含高浓度TB 的试剂造模效果更好。