柴胡皂苷d与阿奇霉素对人型支原体活性的对比研究

贾亚利 刘珏 吴黎明 蔡莺莲 吴盛海

从人体分离出来的支原体有16种，常见与泌尿生殖道感染有关的有解脲支原体（Uu）、人型支原体（Mh）、生殖支原体（Mg）等［1］，其中人型支原体是最常见的致病菌之一，其可以引起非淋球菌性尿道炎、宫颈炎，进而引发前列腺炎、肾盂肾炎、女性盆腔炎等，并可能与不孕不育、习惯性流产、胎儿宫内发育迟缓等有关［2-4］。有报道称，在男性支原体感染可以影响精子的浓度、活动度、形态，且可能破坏生精细胞，从而导致男性不育［5］。临床治疗常选用抗生素治疗，阿奇霉素是指南推荐的一线用药，但耐药率越来越普遍，治疗变成一个棘手的问题，寻找一种有针对性的药物成为治疗的方向［6］。本实验比较柴胡皂苷d（Sd）与阿奇霉素对人型支原体在体外的抗菌活性。

1 材料与方法

1.1 材料 培养基购自珠海迪尔生物工程有限公司。受试菌株人型支原体来自杭州市第一人民医院皮肤科及妇产科的临床分离株。阿奇霉素针剂，购自东北制药企业沈阳第一制药有限公司。柴胡皂苷d购自中国药品生物制品研究所。水溶性柴胡皂苷单体d溶于灭菌的双蒸水，与阿奇霉素针剂均配置成浓度为1280mg/L的备用液，置于-20°冰箱备用，临用前解冻。

1.2 菌株的准备 支原体菌悬液制备和接种20株Mh受试菌株自临床分离传代后，接种至支原体液体培养基，37℃恒温箱中 48h，至生长最佳状态（CFU＞104）［7］，取100μl接种于预热的药物敏感测试板。

1.3 实验方法 棋盘微量稀释法，其能精确测定抗菌药物在不同浓度时对微生物生长的抑制作用。具体方法：阿奇霉素和柴胡皂苷的起始浓度均为256mg/L，并在灭菌管中进行10级倍比稀释。在96孔（12×8）板的前2排中依次加入倍比稀释好的不同浓度的阿奇霉素100μl，在第3和第4排中加入不同浓度的柴胡皂苷d各100μl，在所有测试的40个孔中均加入100μl待测菌液，纵向第11列加200μl待测菌液，不加药物作为生长对照，第12列加入200μl液体支原体培养基，作为空白对照。

1.4 Sd及阿奇霉素对Mh作用的结果判定，接种后的96孔板置于37℃恒温箱中培养48h，采用视觉终点判定。药物敏感终点判读参考M-27中对微量液体培养基稀释法的标准，抗生素类药物以80%抑菌作为观察终点，判断最低抑菌浓度（MIC）。柴胡单体的结果判断参考抗生素类药物进行。

2 结果

Sd对Mh的MIC值在0.25～8mg/L，阿奇霉素对Mh的MIC值在0.25～64mg/L；采用配对t检验，计算出 t=2.3368，查表知 t0.05（19）=2.093，t0.01（20）=2.861，t0.05（19）＜t＜t0.01（20），两组差异有统计学意义（P＜0.05）。Sd 的MIC50为1mg/L，阿奇霉素MIC50为2mg/L。Sd与阿奇霉素在体外对人型支原体均有抑菌作用。Sd对Mh的抑菌作用优于阿奇霉素。见表1、2。

表1 Sd及阿奇霉素对20株人型支原体的MIC（mg/L）

表2 Sd与阿奇霉素对Mh的MIC比例［n（%）］

3 讨论

阿奇霉素属于大环内酯类抗生素，其作为指南推荐的抗支原体一线治疗药物，在临床使用中，胃肠道的副作用发生率较高，多数患者出现恶心、食欲不振等肠胃不适，严重者呕吐。且在近几年研究中发现，其耐药率比例也较高，导致临床治疗失败病例逐渐增多，感染病情迁延不愈［1］。阿奇霉素的抗菌作用，通过与细菌核糖体50s亚基结合，阻碍细菌转肽过程，抑制依赖于RNA的蛋白质合成从而达到抗菌作用。支原体对其耐药产生机制主要是生物膜的形成［8］，生物膜增强Mh对大环内酯类、四环素等多种常用抗生素的抵抗力。

黄峥烨等［9］研究认为柴胡皂苷d对解脲支原体有抑菌作用，发现50株解脲支原体对四环素、红霉素、环丙沙星均有不同程度的耐药，但同时却对Sd显示敏感，即在体外实验中，Sd的抗菌活性优于这三种抗生素。本实验中Sd也显示较强的对于人型支原体的抗菌活性。陈志宝等研究柴胡皂苷a对金黄色葡萄球菌的抑菌作用［10］，采用基因芯片检测，结果表明，柴胡皂苷a作用于金黄色葡萄球菌45min后引起相关基因表达水平的改变在所有监测基因中，26个上调基因，68个下调基因，其中有13个毒力因子的表达受到影响，且表达水平全部下调，即抑制金黄色葡萄菌的毒力水平；1个编码超氧负离子压力反应蛋白基因vraR和vraS被诱导上调；还有4个核黄素合成蛋白ribA，B，H，D被显著抑制，这几个是酶的辅助因子的合成基因，在呼吸代谢途径起作用，同时还与超氧负离子有关。也可以认为柴胡皂苷d的作用机制，可能在基因水平上降低多糖及某些蛋白质的合成从而抑制生物膜的形成。这些均需要进一步的科学实验证实。

新药的临床前药理研究是过渡到临床的重要桥梁，也是评价新药的关键步骤。一个新的化合物或分离提取有效成分是否有抗菌作用，需要药理实验证实。首先采用体外试验方法，观察试验物对病原菌有无杀灭作用或抑制作用。筛选到体外实验有效的化合物应进一步确定其分子结构，为深入研究提供数据。作者观察到的柴胡皂苷单体d在体外实验中，对人型支原体Mh有较好的抑制作用，效果显著强于阿奇霉素，值得对其进行进一步深入研究，也应该测试其对于常见的球菌、杆菌等致病微生物的体外抗菌实验研究，为最终进行动物体内药理研究打下基础。