气相色谱-质谱法/同位素内标法测定白酒中16种邻苯二甲酸酯的优化研究

苏占元，张宿义*，赵金松，4，，张 良，黄小军，杨晓军，许 愿，吴卫宇，杨 平，秦 辉

（1.四川国检检测有限责任公司，四川 泸州 646000；2.泸州老窖股份有限公司，四川 泸州 646000；3.国家固态酿造工程技术研究中心，四川 泸州 646000；4.四川轻化工大学生物工程学院，四川 自贡 643000；5.泸州老窖集团有限责任公司，四川 泸州 646000）

邻苯二甲酸酯（phthalate acid esters，PAEs）是塑化剂中的一种，是工业上常用的高分子材料增塑剂[1-3]。邻苯二甲酸酯常温条件下一般为无色透明的油状黏稠液体，属于脂溶性物质，易溶于正己烷、甲醇、乙醇等有机溶剂[4]。邻苯二甲酸酯可以改变人体内荷尔蒙雌激素水平，被当作内分泌干扰素或环境激素，并可对人体免疫系统和消化系统造成伤害[5-9]。根据2011年原卫生部的通知，邻苯二甲酸酯是可用于食品包装材料的增塑剂，但不是食品原料，也不是食品添加剂，严禁在食品、食品添加剂中人为添加，并且食品、食品添加剂中的邻苯二甲酸二（2-乙基）己酯（dioctyl phthalate，DEHP）、邻苯二甲酸二异壬酯（diisononyl phthalate，DINP）和邻苯二甲酸二正丁酯（dibutylphthalate，DBP）的最大残留量分别为1.5mg/kg、9.0mg/kg和0.3mg/kg[10]，该要求仅用于排查违法添加行为，不是食品安全国家标准。2014年原国家卫计委再次评估，确定对饮酒者健康风险处于可接受水平的DBP限值为1.0mg/kg、DEHP限值为5.0mg/kg。同时，卫计委明确，2014年评估结果仅从保护健康角度得出，未考虑其他相关因素，不是食品安全国家标准[11]。只要排除违法添加行为，白酒中DBP与DEHP满足2014年评估要求，就能保证饮酒者健康风险处于可接受水平。目前大多数白酒厂，将与酒源直接接触的材质已换成食品级不锈钢（通常采用304），但少数小酒厂仍然使用含有塑化剂的塑料接酒桶、塑料输酒管道等，由于邻苯二甲酸酯具有易迁移及在酒精溶剂中具有较好的溶解性特点，长时间接触过程中邻苯二甲酸酯极易迁移到白酒中，容易造成市售散装白酒存在邻苯二甲酸酯含量较高的潜在风险[4，12-14]。因此有必要开展白酒中邻苯二甲酸酯的检测工作，指导白酒行业使其含量处于可控、安全水平。

目前检测白酒中邻苯二甲酸酯的现行有效方法GB 5009.271—2016《食品安全国家标准食品中邻苯二甲酸酯的测定》[15]包括第一法气相色谱-质谱法同位素内标法及第二法气相色谱-质谱法外标法，无论是气相色谱-质谱法同位素内标法还是气相色谱-质谱法外标法，对于白酒的检测，前处理方式均为液液萃取，简单快速成本较低，但是气相色谱-质谱法外标法对质谱灵敏度及稳定性要求较高；气相色谱-质谱法同位素内标法在质谱灵敏度满足检测要求的情况下受质谱稳定性影响较小，检测结果准确、稳定、可靠，但是按照标准要求在液液萃取之前需要手动加入一定量的内标使用液，内标使用液的使用量相对较大造成检测成本的增加，并且手动加内标使用液对检测人员的熟练度准确度要求较高。因此，在保证检测结果准确、稳定、可靠的情况下，有必要对第一法中的气相色谱-质谱法同位素内标法进行优化。

本实验参照现行有效国家标准GB 5009.271—2016《食品安全国家标准食品中邻苯二甲酸酯的测定》，并利用与气相色谱仪匹配的Agilent7693自动液体进样器自动添加内标，对白酒中的邻苯二甲酸酯进行检测，以优化该方法的气相色谱-质谱条件。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

成品白酒：市售；水：符合GB/T 6682—2008《分析实验室用水规格和试验方法》规定的一级水，本实验室自制；正己烷（色谱纯）：美国OMNI公司；25mL具塞磨口离心管：泸州市宏鑫化工有限公司。

16种邻苯二甲酸酯类混合标准溶液（1000mg/L）（邻苯二甲酸二甲酯（dimethylphthalate，DMP）、邻苯二甲酸二乙酯（diethylphthalate，DEP）、邻苯二甲酸二异丁酯（diisobutyl phthalate，DIBP）、邻苯二甲酸二正丁酯、邻苯二甲酸二（2-甲氧基）乙酯（bis（2-methoxyethyl）phthalate，DMEP）、邻苯二甲酸二（4-甲基-2-戊基）酯（bis（4-methyl-2-pentyl）phthalate，BMPP）、邻苯二甲酸二（2-乙氧基）乙酯（bis（2-ethoxyethyl）phthalate，DEEP）、邻苯二甲酸二戊酯（dipentyl phthalate，DPP）、邻苯二甲酸二己酯（dihexyl phthalate，DHXP）、邻苯二甲酸丁基苄基酯（benzyl butylphthalate，BBP）、邻苯二甲酸二（2-丁氧基）乙酯（bis（2-n-butoxyethyl）phthalate，DBEP）、邻苯二甲酸二环己酯（dicyclohexylphthalate，DCHP）、邻苯二甲酸二（2-乙基）己酯、邻苯二甲酸二苯酯（diphenyl phthalate，DPhP）、邻苯二甲酸二正辛酯（dinoctylphthalate，DNOP）、邻苯二甲酸二壬酯（dinonyl phthalate，DNP））：美国o2sismartsolutions公司。

16种氘代同位素的邻苯二甲酸酯内标混合标准溶液（100mg/L）（D4-邻苯二甲酸二甲酯（D4-DMP）、D4-邻苯二甲酸二乙酯（D4-DEP）、D4-邻苯二甲酸二异丁酯（D4-DIBP）、D4-邻苯二甲酸二正丁酯（D4-DBP）、D4-邻苯二甲酸二（2-甲氧基）乙酯（D4-DMEP）、D4-邻苯二甲酸二（4-甲基-2-戊基）酯（D4-BMPP）、D4-邻苯二甲酸二（2-乙氧基）乙酯（D4-DEEP）、D4-邻苯二甲酸二戊酯（D4-DPP）、D4-邻苯二甲酸二己酯（D4-DHXP）、D4-邻苯二甲酸丁基苄基酯（D4-BBP）、D4-邻苯二甲酸二（2-丁氧基）乙酯（D4-DBEP）、D4-邻苯二甲酸二环己酯（D4-DCHP）、D4-邻苯二甲酸二（2-乙基）己酯（D4-DEHP）、D4-邻苯二甲酸二苯酯（D4-DPhP）、D4-邻苯二甲酸二正辛酯（D4-DNOP）、D4-邻苯二甲酸二壬酯（D4-DNP））：美国o2si smartsolutions公司。

1.2 仪器与设备

Agilent7890A GC/5975CMSD气相色谱-质谱联用仪（gaschromatography-massspectrometer，GC-MS）、Agilent7693自动液体进样器：美国Agilent公司；BSA5201电子天平（220g，0.1mg）：赛多利斯科学仪器有限公司；移液枪（0～100μL及100～1 000μL）：大龙医疗设备（上海）有限公司；SK-1涡旋混匀器：金坛市医疗仪器厂；AS3120超声波清洗仪：北京华瑞博远科技发展有限公司；KH19A高速离心机：湖南凯达科学仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 标准溶液配制

配制16种邻苯二甲酸酯标准中间溶液（20mg/L）、16种氘代同位素的邻苯二甲酸酯内标的标准中间溶液（10mg/L）、16种氘代同位素的邻苯二甲酸酯内标的标准使用溶液（0.125mg/L），用正己烷准确定容至刻度，冰箱中0～8℃冷藏避光保存。

1.3.2 样品前处理[15]

准确称取酒样1.0 g于25m L具塞磨口离心管中，加入2～5m L蒸馏水，涡旋均匀，再准确加入10m L正己烷，涡旋1min，剧烈振摇1min，超声提取30min，1 000 r/min离心5m in，取上清液，供GC-MS分析，同时选择与Agilent7890A气相色谱仪配套使用的Agilent7693自动液体进样器并在其L2位置放置1mL质量浓度为0.125mg/L的16种氘代同位素的邻苯二甲酸酯内标的标准使用溶液。

1.3.3 GC-MS条件

色谱柱：HP-5MS（30m×0.25mm×0.25 μm）；载气：高纯氦气（He，99.999%）；流速：1m L/m in；进样方式：不分流进样；进样量：1 μL；进样类型：2层夹层模式，L1气隙0.2 μL，L2体积1 μL，L2气隙0.2 μL；载气节省：20.0m L/m in；进样口温度：280℃；程序升温：初始温度60℃保持1min，以20℃/min升温至220℃保持1min，再以5℃/min升温至280℃保持2min；传输线温度：280℃；离子源：电子电离（electron ionization，EI）源；电离能量：70 eV；离子源温度：230℃，四级杆温度：150 ℃；溶剂延迟：5min；质量扫描范围：30～400m/z。

2 结果与分析

2.1 质谱定性定量[16]

取1m L16种邻苯二甲酸酯标准中间溶液（20mg/L）采用1.3.2的方式，并按照1.3.3条件进行全扫描，得到16种邻苯二甲酸酯及其氘代同位素内标的总离子流色谱图，见图1A；完全按照国标中的气相色谱质谱条件进行全扫描，得到16种邻苯二甲酸酯及其氘代同位素内标的总离子流色谱图，见图1B。并利用美国国家标准与技术研究院（national institute of standardsand technology，NIST）数据库2012标准图谱库进行检索，确定每种物质的保留时间和特征离子碎片，选择丰度相对较高的离子作为定性离子，把丰度较高并且与相邻峰之间无干扰的离子作为定量离子，选择结果见表1和表2。

图1 优化后（A）、优化前（B）16种邻苯二甲酸酯的总离子流色谱图Fig.1 Total ion chrom atogram of 16 phthalate acid esters after(A)and before(B)optim ization

表1 16种D4-邻苯二甲酸酯的保留时间、定性和定量离子Table 1 Retention time,qualitative ion and quantitative ion of 16 D4-phthalate acid esters

表2 16种邻苯二甲酸酯的保留时间、定性和定量离子Table 2 Retention time,qualitative ion and quantitative ion of 16 phthalate acid esters

通过提高进样口温度可以使沸点较高的物质得到充分汽化增加其分离度，同时防止色谱柱污染尤其是柱前端的污染。在色谱图中间流出峰的分离度可以通过改变升温速率来改变，如果分离度过大，可以增加升温速率以减小分离度和缩短分析时间；如果分离度不足，可以减少升温速率来改善，并且减少升温速率时，较晚流出峰的分离度增加更明显[17]。由图1可以看出，优化气相色谱质谱条件前DEHP和DPhP未能有效分离开，通过提高进样口温度及改变程序升温条件后16种目标物质得到了较好的分离，并且峰形对称，说明优化后的色谱条件能够满足检测需求。

2.2 方法线性范围

表3 16种邻苯二甲酸酯的线性范围、线性方程及相关系数Table 3 Linear ranges,linear equations and correlation coefficients(R2)of 16 phthalate acid esters

将16种邻苯二甲酸酯标准中间溶液（20mg/L）用正己烷逐级稀释，配制成质量浓度为0.02mg/L、0.03mg/L、0.05mg/L、0.10mg/L、0.15mg/L、0.20mg/L的标准系列溶液，采用1.3.2的方式，并按照1.3.3条件上机测定。以邻苯二甲酸酯各组分及其对应氘代同位素内标峰面积比值为纵坐标，以系列标准溶液中各组分含量（mg/L）与对应氘代同位素内标含量（mg/L）比值为横坐标，绘制标准曲线，并得到各组分的线性回归方程和相关系数R2，结果见表3。

由表3可以看出，在0.02～0.20mg/L范围内，16种邻苯二甲酸酯的线性回归方程均具有良好的线性关系R2≥0.998。

2.3 方法检出限、精密度和加标回收率

检出限和定量限主要是考察方法的灵敏度；而回收率主要是考察方法的准确度[16]。取本底中不含这16种邻苯二甲酸酯的白酒样品，分别按0.3mg/kg、0.5mg/kg及1.0mg/kg的水平添加，每个水平检测6次，考察该方法的精密度、加标回收率；并利用0.5mg/kg的浓度水平为依据，3倍信噪比计算检出限，10倍信噪比计算定量限[18-20]，结果见表4。

由表4可以看出，3个质量浓度水平的16种邻苯二甲酸酯平均回收率为88.6%～106.1%，相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）为1.6%～4.3%；DBP的定量限为6.6×10-3mg/kg，其余15种均小于3.0×10-2mg/kg，完全满足标准中DBP定量限为0.3mg/kg，其余15种均为0.5mg/kg的要求。说明本方法具有较好的准确度和灵敏度，能够满足白酒中16种邻苯二甲酸酯的检测。

表4 16种邻苯二甲酸酯的方法检出限、精密度和加标回收率实验结果（n=6）Table 4Detection lim its,precision and adding standard recovery of16 phthalate acid esters(n=6)

2.4 实际样品分析

利用本实验所建立的方法，对市售5份不同白酒样品的16种邻苯二甲酸酯含量进行检测，每个样品平行测定6次，检测结果见表5。由表5可知，5份白酒样品有检出的主要集中在DIBP、DBP及DEHP，其中DBP均有检出，其余指标均未检出。

表5 5份白酒样品中16种邻苯二甲酸酯的测定结果（n=6）Table 5 Determ ination results of 16 phthalate acid esters in5 Baijiu samples(n=6)

3 结论

参照现行有效国家标准GB 5009.271—2016《食品安全国家标准食品中邻苯二甲酸酯的测定》，对该方法中的气相色谱及质谱条件进行优化，并利用与气相色谱仪匹配的自动液体进样器自动添加内标，对白酒中的16种邻苯二甲酸酯进行检测。优化条件后，能使白酒中16种邻苯二甲酸酯得到较好的分离，在0.02～0.20mg/L范围内，16种邻苯二甲酸酯具有良好的线性关系，R2≥0.998。邻苯二甲酸二正丁酯（DBP）的定量限为6.6×10-3mg/kg，其余15种的定量限均小于3.0×10-2mg/kg，平均回收率为88.6%～106.1%，RSD为1.6%～4.3%。本实验所建立的方法能够节省内标使用量，并且具有较高的准确度和灵敏度，能够满足上述国标对白酒中邻苯二甲酸酯检测的要求，进而对于指导白酒行业使邻苯二甲酸酯含量处于可控、安全水平具有现实意义。